一种羰基还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体及其应用。本发明专利技术羰基还原酶突变体的野生菌来源于Rhodotorula toruloides，经定点突变获得与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变的突变体；在对应于SEQ ID NO.:1的氨基酸序列的第1至247位中仅存在下述之一的突变：T147A；G190A；E93S；L95A；D195S；E203A。本发明专利技术的羰基还原酶突变体实现在(2S，3R)

【技术实现步骤摘要】
一种羰基还原酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种羰基还原酶突变体，还涉及上述突变体的应用。

技术介绍

[0002]生物法催化羰基化合物的不对称还原是制备手性醇的重要方法，近年来已成为有机合成的研究热点。该反应由羰基还原酶催化，常用于合成一些高附加值的手性药物中间体，与传统的化学法相比，利用生物催化剂催化前手性羰基化合物的不对称还原具有显著优势。
[0003](2S，3R)
‑2‑
苯甲酰氨甲基
‑3‑
羟基丁酸甲酯((2S，3R)
‑
BHBM)是一种具有光学活性的β
‑
羟基酯类物质，也是手性醇的一种，其化学结构式如式(II)所示。(2S，3R)
‑
BHBM是合成(3R，4R)
‑3‑
[(R)
‑1‑
叔丁基二甲基硅氧乙基]‑4‑
乙酰氧基
‑2‑
氮杂环丁酮(简称为4
‑
AA)的关键起始原料，4
‑
AA是一种重要的医药精细化学品，主要用于合成各类培南类的抗生素，如亚胺培南、比阿培南、美罗培南和法罗培南等。这些药物用途广泛，对革兰阴性和阳性菌、需氧菌、厌氧菌等均具有广谱强效抗菌作用，因而受到人们极大重视。目前，在(2S，3R)
‑
BHBM的手性合成工艺方面，主要有两种方法。一种是化学合成法，该法需要贵重金属钌作为催化剂，且反应需要在高温高压条件下进行，对反应器的要求较高，限制了(2S，3R)
‑
BHBM的大规模工业化生产。另一种是生物催化法，通过羰基还原酶不对称还原外消旋2－苯甲酰胺甲基
‑3‑
羰基丁酸甲酯(BOBM)制备(2S，3R)
‑
BHBM。该方法可以有效解决传统化学法存在的不足，同时降低生产成本，提高生产效率，是(2S，3R)
‑
BHBM工业化生产的发展趋势。目前，亟需提供一种可以高效催化该反应的羰基还原酶。
[0004]CN 112941043 A公开了一种羰基还原酶突变体及在制备手性β
’‑
羟基
‑
β
‑
氨基酸酯中的应用。该专利技术提供了一种羰基还原酶突变体及其在(2S，3R)
‑2‑
苯甲酰氨甲基
‑3‑
羟基丁酸甲酯合成中的应用，具体地，所述羰基还原配的野生型来源于Sporobolomyces salmonicolor，经定点突变获得与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变的突变蛋白，其具有显著提高催化β
’‑
羰基
‑
β
‑
(保护)氨基酸酯化合物的活性。
[0005]上述文献与本专利技术相比，存在以下局限：(1)缓冲体系不同：该专利中的酶要起到好的催化效果，需要在缓冲体系中添加甲醇、丙酮，二氯甲烷等助溶剂，而添加助溶剂后会导致后续提纯工艺繁琐且产生大量的有机废水，不利于环保；而本专利技术中的酶在仅用水作为反应介质的条件下即可达到良好的反应效果，环保的同时达到了很好的反应速率和产物纯度；(2)本专利技术的酶基因是通过基因挖矿技术获得的全新酶基因，与上述文献所用酶基因相比，相似度较低；(3)上述文献的羰基还原酶最适反应温度为28℃，而本专利技术的羰基还原酶突变体可以耐受更高的反应温度，更有利于工业化生产和储存。

技术实现思路

[0006]为了解决上述的技术问题，本专利技术提供了一种羰基还原酶突变体。本专利技术旨在挖
掘高效的羰基还原酶突变体，并通过基因工程手段对其进行改造，获得性能明显提升的羰基还原酶突变体；改造后的羰基还原酶突变体合成手性(2S，3R)
‑
BHBM的活力和立体选择性显著提高。
[0007]本专利技术羰基还原酶突变体的野生菌来源于Rhodotorula toruloides，经定点突变获得与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变的突变体；
[0008]本专利技术提供的羰基还原酶突变体，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％以上的同一性，且所述突变体具有合成手性(2S，3R)
‑
BHBM的能力，并且催化活性和立体选择性显著提高。
[0009]本专利技术提供一种羰基还原酶突变体，在对应于SEQ ID NO.:1的氨基酸序列的第1至247位中仅存在第93，95，147，190，195，203在内的单个位点突变。
[0010]优选的，上述突变体在对应于SEQ ID NO.:1的氨基酸序列的第1至247位中仅存在下述之一的突变：T147A；G190A；E93S；L95A；D195S；E203A；其氨基酸序列为SEQ ID NO.3
‑
8之一所示。
[0011]所述的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0012]本专利技术还提供上述突变体的编码基因，进一步提供含所述基因的表达载体、重组细胞。
[0013]本专利技术所述的羰基还原酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
[0014](1)合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因，得到SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0015](2)将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列进行定点突变，得到SEQ ID NO:3
‑
8的编码基因；
[0016](3)将SEQ ID NO:3
‑
8的编码基因进行基因克隆，得到含有羰基还原酶突变体编码基因的质粒；
[0017](4)将含有羰基还原酶突变体编码基因的质粒导入感受态细胞中，得到羰基还原酶突变体的表达菌株；
[0018](5)羰基还原酶突变体的表达菌株进行诱导发酵，得到羰基还原酶突变体。
[0019]本专利技术还提供了利用羰基还原酶突变体制备的培南类药物中间体手性(2S，3R)
‑3‑
羰基
‑
2(邻苯二甲酰亚胺)甲基丁酸甲酯化合物。
[0020]上述(2S，3R)
‑3‑
羰基
‑
2(邻苯二甲酰亚胺)甲基丁酸甲酯化合物，是以表达所述羰基还原酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以β
‑
羰基
‑
β
‑
氨基酸酯化合物为底物，以水作为反应介质，在pH6.0
‑
8.5，温度30
‑
55℃条件下进行催化反应获得的。
[0021]优选的，上述底物的浓度为200
‑
400g/L，菌体的浓度为10
‑
20g/L，反应体系的pH为6.0
‑
8.5，反应温度为30
‑
55℃。
[0022]优选的，上述制备(2S，3R)
‑3‑
羰基
‑
2(邻苯二甲酰亚胺)甲基丁酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，在对应于SEQ ID NO.:1的氨基酸序列的第1至247位中仅存在第93，95，147，190，195，203在内的单个位点突变。2.如权利要求1所述的一种羰基还原酶突变体，其特征在于，在对应于SEQ ID NO.:1的氨基酸序列的第1至247位中仅存在下述之一的突变：T147A；G190A；E93S；L95A；D195S；E203A。3.如权利要求1或2所述的羰基还原酶突变体的编码基因。4.如权利要求1或2所述的羰基还原酶突变体的编码基因的表达载体。5.如权利要求1或2所述的羰基还原酶突变体的编码基因的重组细胞。6.如权利要求1或2所述的羰基还原酶突变体在制备培南类药物中间体手性(2S，3R)
‑2‑
苯甲酰氨甲基
‑3‑
羟基丁酸甲酯化合物中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，是以表达所述羰基还原酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以β
‑
羰基
‑
β
‑
氨基酸酯化合物为底物，以水作...

【专利技术属性】
技术研发人员：马钦元，魏浩，曹永军，高秀珍，尹炎淼，张祥鹤，赵艳玲，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：