结合CD20的二聚体抗原受体（DAR）制造技术

本公开提供了结合CD20靶抗原的二聚体抗原受体(DAR)构建体，其中所述DAR构建体包含一条多肽链上的重链结合区以及单独的另一多肽链上的轻链结合区。构成所述二聚体抗原受体的两条多肽链可以二聚化以形成抗原结合结构域。所述二聚体抗原受体具有抗体样特性，因为所述二聚体抗原受体与靶抗原特异性结合。所述二聚体抗原受体可以用于定向细胞疗法。体抗原受体可以用于定向细胞疗法。体抗原受体可以用于定向细胞疗法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合CD20的二聚体抗原受体(DAR)
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年2月27日提交的美国临时申请第62/982,348号和于2020年10月9日提交的美国临时申请第63/089,869号的优先权的权益，所述美国临时申请中的每个申请的内容通过引用以其整体并入本文。
专利

[0003]本公开提供了表达特异性结合CD20的二聚体抗原受体(DAR)的转基因细胞、编码二聚体抗原受体的核酸、包含核酸的载体以及使用转基因细胞治疗疾病的方法。

技术介绍

[0004]嵌合抗原受体(CAR)已经被开发到靶向特别是与癌症相关的抗原。第一代CAR被工程化为含有仅递送活化刺激(信号1)的信号传导结构域(TCRζ)(Geiger等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》162(10):5931
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5939,1999；Haynes等人,《免疫学杂志》166(1):182
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187,2001)(Hombach等人《癌症研究(Cancer Res.)》61(5):1976
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1982,2001；Hombach等人,《免疫学杂志》167(11):6123
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6131,2001；Maher等人,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》20(1):70
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75,2002)。仅用第一代CAR移植的T细胞由于不理想的活化作用而展现出有限的抗肿瘤功效(Beecham等人,《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》23(6):631
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642,2000)。第二代CAR，即免疫球蛋白
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CD28
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T细胞受体(IgCD28TCR)，将CD28共刺激结构域(信号2)并入到第一代受体中(Gerstmayer等人,《免疫学杂志》158(10)4584
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4590,1997；Emtage等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》14(24):8112
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8122,2008；Lo,Ma等人,《临床癌症研究》16(10):2769
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2780,2010)，这导致CAR
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T细胞具有更强的抗肿瘤能力(Finney等人,《免疫学杂志》161(6):2791
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2797,1998；Hombach等人,《癌症研究》61(5):1976
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1982,2001,Maher等人,《自然生物技术》20(1):70
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75,2002)。通过用具有类似功能的分子(如FcRγ、4
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1BB和OX40)替代TCRζ或CD28的信号结构域，已经开发了各种CAR变体(Eshhar等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U S A)》90(2):720
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724,1993)。已经开发了针对各种肿瘤抗原的TCR CAR
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T细胞(Ma等人,《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)》11(4):297
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306,2004；Ma等人,《前列腺(Prostate)》61(1):12
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25,2004；Lo等人,《临床癌症研究》16(10):2769
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2780,2010；Kong等人,《临床癌症研究》18(21):5949
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5960,2012；Ma等人,《前列腺》74(3):286
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296,2014；Katz等人,《临床癌症研究》21(14):3149
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3159,2015；Junghans等人,2016《前列腺》,76(14):1257
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1270)。
[0005]通过输注用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞用于重定向杀瘤活性的过继免疫疗法代表了用于治疗转移癌的潜在高特异性形式。靶向CD19(即在B细胞上表达的分子)的CAR
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T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤上已经获得成功并且已经获得FDA批准，其中一些试验示出高达70％的应答率，包括持续的完全应答。(替沙仑赛)CD19 CAR
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T细胞被批准用于B细胞ALL；(阿基仑赛)CD19 CAR
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T细胞被批准用于大B细胞淋巴瘤；并且(布瑞基奥仑赛)CD19 CAR
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T细胞被批准用于大B细胞淋巴瘤。

技术实现思路

[0006]本文公开了包含两种多肽的工程化抗原受体，第一多肽包含抗体重链结合区，并且第二多肽包含抗体轻链结合区。工程化受体可以由细胞表达，在治疗上用于为癌症患者提供改善的治疗。
[0007]在一些实施方式中，本专利技术提供了包含第一多肽链和第二多肽链的二聚体抗原受体(DAR)，所述第一多肽链和第二多肽链包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区并且可以缔合以形成Fab片段，其中多肽链中的一个包含其它受体或免疫球蛋白家族分子的跨膜区和胞内区，从而将Fab片段锚定到宿主细胞膜上并提供信号传导能力。例如，Fab片段可以针对肿瘤抗原。本公开提供了编码DAR的核酸构建体和用编码DAR的构建体转染的细胞。如DAR
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T细胞等表达DAR的细胞可以在治疗上使用，例如可以施用于癌症患者以治疗癌症。
[0008]在一些实施方式中，相对于表达CAR的T细胞，表达DAR的T细胞可以在根除体内肿瘤方面显示出改善的疗效。
[0009]在一些实施方式中，相对于表达CAR的T细胞，表达DAR的T细胞可以在接受癌症治疗的受试者体内表现改善的持久性。
[0010]在本文公开的特定实施方式中，DAR可以包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含结合CD20的抗体的重链可变区，并且所述第二多肽包含结合CD20的抗体的轻链可变区。在各个实施方式中，第一多肽包含重链可变区、重链恒定区、铰链区、跨膜区和至少一个胞内信号传导结构域。第二多肽可以包含结合CD20的抗体的轻链可变区，并且可以进一步包含轻链恒定区。
[0011]在各个实施方式中，抗体区可以源自人抗体序列、人源化抗体序列或全人抗体。
[0012]在各个实施方式中，第一多肽包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变区。包含结合CD20的抗体的重链可变区的第一多肽可以进一步包含重链恒定区(例如，SEQ ID NO:4或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列)、铰链区(例如，CD8铰链区、CD28铰链区、与其任一个具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列、或其组合)、跨膜区(例如，CD8跨膜区、4
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1BB跨膜区、CD3ζ跨膜区、与其任一个具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列、或其任何组合)和至少一个胞内信号传导本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种表达结合CD20的二聚体抗原受体(DAR)的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述DAR包含：a.第一多肽，所述第一多肽包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)抗体重链可变区；(ii)抗体重链恒定区；(iii)跨膜区；以及(iv)胞内区；以及b.第二多肽，所述第二多肽包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)抗体轻链可变区；以及(ii)抗体轻链恒定区；其中所述抗体重链恒定区和所述抗体轻链恒定区形成二聚化结构域以形成所述DAR，并且其中所述抗体重链可变区和所述抗体轻链可变区形成结合CD20的抗原结合结构域。2.一种表达结合CD20的二聚体抗原受体(DAR)的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述DAR包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)抗体轻链可变区；(ii)抗体轻链恒定区；(iii)跨膜区；以及(iv)胞内区；以及b)第二多肽链，所述第二多肽链包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)抗体重链可变区；以及(ii)抗体重链恒定区；其中所述抗体重链恒定区和所述抗体轻链恒定区形成二聚化结构域以形成所述二聚体抗原受体(DAR)，并且其中所述抗体重链可变区和所述抗体轻链可变区形成结合CD20的抗原结合结构域。3.根据权利要求1或2所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述抗体重链恒定区和所述抗体轻链恒定区通过一个或两个二硫键二聚化。4.根据权利要求1或2所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述抗体重链恒定区和所述抗体轻链恒定区通过一个或两个二硫键二聚化。5.根据权利要求1或2所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其在a)部分中进一步包含铰链区，其中所述铰链区位于所述抗体恒定区与所述跨膜区之间。6.根据权利要求5所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述铰链区包含来自选自由以下组成的组的抗体的铰链序列：IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。7.根据权利要求5所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述铰链包含CD28铰链区。8.根据权利要求5所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述铰链区包含CPPC或SPPC的氨基酸序列。9.根据权利要求1或2所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述跨膜区包含来自CD28的跨膜序列。10.根据权利要求1或2所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述胞内区包含一个或多个选自由以下组成的组的胞内氨基酸序列：4
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1BB胞内区(SEQ ID NO:7)、具有ITAM 1、2和3的CD3ζ、具有ITAM 1的CD3ζ、具有ITAM 3的CD3ζ(SEQ ID NO:8)，或CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD
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1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA
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1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7
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H3、GITR(TNFRSF18)、DR3(TNFRSF25)、TNFR2和/或CD226中任一者的胞内区，或与其中任一者具有至少95％同一性的胞内氨基酸序列。11.根据权利要求1所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中
所述抗体重链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列。12.根据权利要求11所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述抗体重链恒定区包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列。13.根据权利要求11所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述抗体轻链可变区包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的氨基酸序列。14.根据权利要求1所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述抗体轻链恒定区包含与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的氨基酸序列。15.根据权利要求1所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述铰链区包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的氨基酸序列。16.根据权利要求1所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述跨膜区包含与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的氨基酸序列。17.根据权利要求1或2所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述胞内区包含以下中的两个或更多个的任何组合：i)4
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1BB胞内共刺激序列(SEQ ID NO:7)；ii)包含ITAM 1、2和3的CD3ζ氨基酸序列；iii)包含ITAM 1的CD3ζ氨基酸序列；iv)包含ITAM 2的CD3ζ氨基酸序列；和/或v)包含ITAM 3的CD3ζ氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。18.根据权利要求1或2所述的二聚体抗原受体，其中所述胞内区包含：i)来自CD28和来自具有ITAM 1、2和3的CD3ζ的胞内序列；ii)来自4
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1BB和来自具有ITAM 1、2和3的CD3ζ的胞内序列；iii)来自CD28、来自4
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1BB和来自具有ITAM 1、2和3的CD3ζ的胞内序列；iv)来自4
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1BB(SEQ ID NO:7)和来自具有ITAM 3的CD3ζ(SEQ ID NO:8)的胞内序列；v)来自CD28和来自具有ITAM 3的CD3ζ的胞内序列；或vi)来自CD28、来自4
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1BB和来自具有ITAM 3的CD3ζ的胞内序列。19.根据权利要求1所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。20.根据权利要求19所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中所述第二多肽链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。21.根据权利要求1所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中a)所述第一多肽链包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体重链可变区；(ii)包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体重链恒定区；(iii)包含CD8和CD28铰链区的铰链区；(iv)包含与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD28跨膜区；以及(v)包含CD28和CD3ζITAM 1、2和3的胞内区；并且其中b)所述第二多肽链包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体轻链可变区；以及(ii)包含与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体轻链恒定区，其中所述抗体重链恒定区和所述抗体轻链恒定区形成二聚化结构域，并且
其中所述抗体重链可变区和所述抗体轻链可变区形成结合CD20蛋白的抗原结合结构域。22.根据权利要求1所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中a)所述第一多肽链包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体重链可变区；(ii)包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体重链恒定区；(iii)包含CD28铰链区的铰链区，所述CD28铰链区包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的氨基酸序列；(iv)包含与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD28跨膜区；以及(v)包含4
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1BB和CD3ζITAM 1、2和3胞内序列的胞内区；并且其中b)所述第二多肽链包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体轻链可变区；以及(ii)包含与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体轻链恒定区，其中所述抗体重链恒定区和所述抗体轻链恒定区形成二聚化结构域，并且其中所述抗体重链可变区和所述抗体轻链可变区形成结合CD20蛋白的抗原结合结构域。23.根据权利要求1所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中a)所述第一多肽链包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体重链可变区；(ii)包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体重链恒定区；(iii)包含CD28铰链区的铰链区，所述CD28铰链区包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的氨基酸序列；(iv)包含与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD28跨膜区；以及(v)包含CD28和CD3ζITAM 1、2和3的胞内区；并且其中b)所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个多肽区：(i)包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体轻链可变区；以及(ii)包含与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体轻链恒定区，其中所述抗体重链恒定区和所述抗体轻链恒定区形成二聚化结构域，并且其中所述抗体重链可变区和所述抗体轻链可变区形成结合CD20蛋白的抗原结合结构域，并且其中所述二聚体抗原受体(DAR)构建体是DAR V2b构建体。24.根据权利要求1所述的经基因修饰的宿主细胞或经基因修饰的宿主细胞群体，其中a)所述第一多肽链包含从氨基末端到羧基末端顺序的多个多肽区：(i)包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体重链可变区；(ii)包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体重链恒定区；(iii)包含CD28铰链区的铰链区，所述CD28铰链区包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的氨基酸序列；(iv)包含与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD28跨膜区；以及(v)包含4
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1BB和CD28和CD3ζITAM 1、2和3胞内序列的胞内区；并且其中b)所述第二多肽链包含从氨基末端排序到羧基末端的多个多肽区：(i)包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体轻链可变区；以及(ii)包含与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的氨基酸序列的CD20抗体轻链恒定区，其中所述抗体重链恒定区和所述抗体轻链恒定区形成二聚化结构域，并且
其中所述抗体重链可变区和所述抗体轻链可变区形成结合C...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：索伦托药业有限公司，
类型：发明
国别省市：