【技术实现步骤摘要】
用于高效表达纯化小标签活性融合蛋白的Gateway原核载体系统
[0001]本专利技术涉及一件快速高效表达活性蛋白的Gateway原核载体系统。
技术介绍
[0002]Gateway系统是一套高效精确的分子克隆技术。该套系统只需要两个简单的LR或BP反应，就能使目标序列在表达载体(Destination vector)和入门载体(ENTR vector)之间随意高效准确转换，且能保证每个目标序列的旁侧序列都高度一致。蛋白质的活性功能是生命力的体现。研究蛋白的结构，功能和活性一直是生物学研究的基本目标之一。将某一功能蛋白在非变性条件下纯化，测试其各种生物属性，是实现这一基本目标的主要途径。但现有的蛋白原核表达载体系统，往往采用低效过时的酶切连接系统，耗时费力，筛选克隆时假阳性比例高，而且不能保证每种表达出来的小标签融合蛋白都有完全一致的旁侧连接序列，对照性不强。因此，我们希望开发一套能利用Gateway分子克隆技术的新的载体系统，帮助我们更加高效精确的表达大量活性目标蛋白，杜绝分子克隆过程中的假阳性问题，并解决不同融合蛋白之间...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于高效表达纯化小标签活性融合蛋白的Gateway原核载体系统，其特征在于，具体制作方法包括以下内容：1)以PET30a载体为底物，利用限制性内切酶BamHI和HindIII对其进行双酶切，得到酶切产物，并对酶切后的主片段进行纯化；2)设计带有重组位点的Gateway座位序列扩增正向引物PET30a
‑
GWF(5
’‑
ccatggctgatatcggatccACAAGTTTGTACAAAAAAGC
‑3’
)以及反向引物PET30a
‑
GWR(5
’‑
gtgcggccgcAAGCTTGACCACTTTGTACAAGAAAGCTG
‑3’
)，以载体pB2GW7为模板，扩增带有attR1和attR2两个LR反应位点，以及CmR和ccdB两个开放阅读框的PCR片段；3)检测PCR产物，并将正确片段长度的PCR产物纯化；4)将纯化后的PET30a主片段和纯化后的PCR产物按一定比例混合，加入重组酶MultiS和buffer，配制成反应体系，37度恒温反应半小时；5)将反应好的重组产物导入大肠杆菌DB3.1感受态细胞，加入适量SOC液态培养基，37度摇床200rpm/min孵育1小时后，涂抹适量该生长液于含有卡那霉素的固体LB培养基平板上，并放入37度生长箱过夜培养；6)设计一条位于PET30a骨架上T7启动子内的正向引物T7F(5
’‑
TTAATACGACTCACTATAG
‑3’
)，以及一条位于PCR连接产物上的反向引物CmRR1(5
’‑
ATCACAGACGGCATGATGAA
‑3’
)，用于对单克隆的PCR检测；7)培养皿平板上长出适当大小的克隆后，挑取部分单克隆溶于20ul水中，取其中1.5ul作为样品模板，利用设计好的一对检测引物，配制成20ul PCR反应体系，对这些克隆进行检测，若PCR能扩增出预期大小的片段，则说明重组反应可能成功；8)挑取能扩增出预期大小片段的单克隆接种于5ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37度摇床200rpm/min过夜培养；9)利用试剂盒提取单克隆质粒；10)将提取好的单克隆质粒进行测序检验，若测序结果和理论设计完...
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