产生真核生物可翻译mRNA并将其传递给真核生物的微生物系统技术方案

一种用于产生真核生物可翻译mRNA并将其传递给真核生物细胞的细菌系统。该系统使用侵入性非致病性细菌以产生功能性mRNA货物并将其传递给真核生物细胞。此外，该系统使用细菌以产生可从细菌细胞中提取的功能性mRNA，用于下游应用。细菌包含至少一种编码mRNA的原核生物表达盒；该mRNA包含细菌转录的聚

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生真核生物可翻译mRNA并将其传递给真核生物的微生物系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年1月11日提交的第62/959976号美国临时申请和2020年11月25日提交的第63/118593号美国临时申请的利益。


[0003]本专利技术涉及信使核糖核酸(mRNA)的制备。更具体地说，本专利技术涉及一种在细菌内产生mRNA的原核生物表达系统，该原核生物表达系统可进一步用作细菌递送载体，用于递送到真核生物宿主细胞并立即翻译成蛋白质。

技术介绍

[0004]细胞使用信使RNA(mRNA)以将细胞DNA中编码的信息翻译成蛋白质。由于mRNA可以编码任何蛋白质，因此这种核酸具有用于治疗的潜力。在其中一种情况下，外源mRNA被传递到宿主细胞并转化为一种或多种蛋白质，包括酶、抗体和抗原，这些蛋白质可以在广泛的治疗应用中发挥作用。然而，外源mRNA必须安全、高效地传递，并作为能够翻译成蛋白质的分子。目前，还没有系统能够在不整合到宿主基因组中进行适当处理的情况下生成和安全有效地传递完全可翻译的mRNA。也可以使用微生物系统产生mRNA。在这种情况下，外源mRNA在细菌细胞内产生，并从细菌细胞中收集，用于下游翻译成蛋白质，包括酶、抗体和抗原，这些蛋白质可以在真核生物细胞内广泛的治疗和非治疗应用中发挥作用。然而，外源产生的(即细菌产生的)mRNA必须是能够真核翻译成蛋白质的分子。目前，没有完整的系统能够在细菌细胞内生成真核生物可翻译mRNA，而不需要在试管中进行转录后处理或整合到宿主基因组中进行适当处理。在本文中，真核生物可翻译mRNA是指在5
’‑
和3
’‑
端包含所需元件的mRNA，其支持mRNA在真核生物细胞内翻译成蛋白质。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种细菌系统，用于真核生物可翻译mRNA的可扩展微生物生物制造(也称为生产或产生)，以及在某些情况下，在需要的情况下，将真核生物可翻译mRNA随后在细胞内传递到真核生物细胞。为了将真核生物可翻译mRNA的生成和传递结合到真核生物细胞，该系统使用侵入性非致病性细菌生成mRNA货物并将其传递到真核生物细胞。在微生物产生真核生物可翻译mRNA的情况下，该系统使用非致病细菌生成mRNA，该mRNA可以以在真核生物细胞中具有功能的形式提取。细菌包含至少一种编码染色体或质粒上mRNA的原核表达盒；mRNA包含由细菌转录的聚
‑
A序列和5
’
帽或伪帽元件，例如内部核糖体进入位点(IRES)元件，其介导真核宿主细胞中的核糖体募集和翻译。治疗性mRNA功能的示例包括但不限于在宿主中提供编码抗体和缺陷基因的遗传物质。本系统中用于驱动细菌细胞内mRNA表达的启动子仅在细菌内可操作，并在真核生物细胞中不可操作。本系统中使用的启动子驱动基因的表达。使用该系统生成和/或传递的mRNA转录物在从细菌中提取时或在细菌介
导的传递时可在真核宿主细胞中翻译，从而可以在无需额外转录后处理的情况下翻译为蛋白质。如果将mRNA用于治疗应用，这有助于简化mRNA制备方法，并缩短临床效果时间。mRNA用于研究中的一般应用的非治疗性mRNA功能示例包括但不限于为体外翻译成多肽提供遗传物质。
[0006]在某些实施方案中，本专利技术提供可用于治疗应用的mRNA。然而，本专利技术对正在生成和在某些实施方案中传递的mRNA的性质不可知。我们制造的不仅仅是治疗性mRNA；mRNA是mRNA。例如，生成和传递的mRNA可用于治疗目的，也可用于体外研究，例如确定细胞中特定mRNA的作用或该mRNA表达的多肽的作用。
[0007]在第一方面中，本专利技术提供一种用于产生真核生物可翻译mRNA的细菌系统。该系统可以包括具有至少一种原核生物表达盒的细菌，该表达盒需要仅在细菌细胞中可操作的启动子，其中该原核生物表达盒编码至少一种mRNA分子，并且其中该mRNA分子包含用于在真核生物细胞中翻译成蛋白质的真核生物可翻译元件。用于驱动原核生物表达盒表达的启动子通常是在真核生物细胞中不起作用的启动子。然后，mRNA分子可以被原核生物RNA聚合酶转录。在第一方面的专利技术背景下，细菌被工程化以表达来自细菌染色体上序列的含有真核生物可翻译元件的至少一种mRNA分子。使用至少一种质粒(也称为载体)转化细菌，该质粒设计为表达至少一种包含真核生物可翻译元件的mRNA分子。目标真核生物细胞可以是动物或植物细胞，包括分裂或非分裂细胞。第一方面的mRNA分子将具有能够进行真核核糖体募集的5
’
帽或伪帽状元件、以及包含聚
‑
A尾的3
’
端，导致产生在细菌细胞内产生的真核生物可翻译mRNA分子。用于翻译成蛋白质的真核生物可翻译元件包括病毒或真核生物细胞内部核糖体进入位点(IRES)元件。在某些实施方案中，编码的mRNA分子具有细菌转录的聚
‑
A区域和5
’
伪帽元件，其将通过内部核糖体进入位点(IRES)元件介导真核生物宿主细胞中的翻译起始。进一步设想，该细菌包括(例如通过质粒)用于稳定mRNA分子上的聚
‑
A尾的聚
‑
A结合蛋白。聚
‑
A区域可以包含1
‑
500个A。在某些实施方案中，细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。第一方面中定义的组合物可用于医学、疾病预防、治疗或研究应用。如第一方面中所定义之组合物可包含于医药上可接受的制剂中。
[0008]在第二方面中，本专利技术提供一种原核生物表达盒。该原核生物表达盒包括可在细菌细胞中操作的原核生物启动子。原核生物表达盒编码至少一种mRNA分子，其中mRNA分子包含传递到真核生物细胞细胞质时翻译成蛋白质所需的元件。在某些实施方案中，盒进一步编码细胞进入介体和内体释放介体。细胞进入介体可以是侵入素蛋白(例如由inv基因编码)或其片段或结合域，并且内体释放介体可以是李斯特菌溶血素O(LLO)(例如hlyA基因)。IRES元件，例如病毒IRES元件，可以包括在mRNA序列和mRNA序列的5
’
区域中以促进核糖体募集。在某些实施方案中，表达盒的5
’
端包含能够进行真核核糖体募集的帽或帽状元件，并且3
’
端包含导致细菌细胞内产生的真核生物可翻译mRNA分子的聚
‑
A尾。聚
‑
A区域可包含1至约500个A。第二方面的原核生物表达盒可包含在侵袭性非致病性细菌中。
[0009]各个方面的mRNA可以是具有功能的治疗性mRNA，包括但不限于提供编码抗体或抗体片段的遗传材料或提供拯救宿主中缺陷基因的遗传材料。合成的转录mRNA分子可以用元件转录，以促进mRNA分子的环状构象。
[0010]在进一步的方面和实施方案中，mRNA分子在生物制造系统中产生并收集用于下游应用。
[0011]真核生物可翻译mRNA在转录后可以在细菌中循环。例如，噬菌体T4置换内含子
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，包含工程化以具有至少一种编码真核生物可翻译mRNA的表达盒的细菌，所述真核生物可翻译mRNA包含5'伪帽元件、编码多肽的核酸序列和聚
‑
A尾，其中所述真核生物可翻译mRNA的转录受原核生物启动子的控制。2.根据权利要求1所述的用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，其中所述5'伪帽元件是内部核糖体进入序列(IRES)。3.根据权利要求1所述的用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，其中IRES是从蟋蟀麻痹病毒(CrPV)IRES、口蹄疫病毒(FMDV)IRES和猪瘟病毒(CSFV)IRES组成的组中选择的IRES或表1
‑
3中列出的IRES。4.根据权利要求1所述的用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，其中所述细菌是工程化以具有至少一种侵袭因子的非致病性细菌。5.根据权利要求1所述的用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，其中所述细菌工程化以转录真核生物可翻译mRNA，该mRNA在其转录时在所述细菌中循环。6.一种用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，包含工程化以具有至少一种侵袭因子并且具有至少一种编码真核生物可翻译mRNA表达盒的非致病细菌，所述真核生物可翻译mRNA包含IRES、编码多肽的核酸序列和聚
‑
A尾，其中所述真核生物可翻译mRNA的转录受原核生物启动子的控制。7.一种用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，包含具有至少一种表达盒的细菌，该表达盒包含编码真核生物可翻译mRNA的序列，其中所述编码真核生物可翻译mRNA的序列的转录受在真核生物细胞中不活跃的启动子控制，并且其中所述真核生物可翻译mRNA分子包含允许在真核生物细胞中翻译多肽的真核生物衍生序列元件。8.根据权利要求7所述的用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，其中所述编码真核生物可翻译mRNA的序列工程化以位于所述细菌的染色体上。9.根据权利要求7所述的用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，其中所述表达盒是包含编码至少一种包含真核生物可翻译元件的mRNA分子的序列的质粒。10.根据权利要求7所述的用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，其中所述表达盒包含编码真核生物可翻译mRNA的序列，该序列的5
’
端包含能够进行真核生物核糖体募集的5
’
帽或伪帽状元件，并且3
’
端包含导致细菌细胞内产生的真核生物可翻译mRNA分子的聚
‑
A尾。11.根据权利要求7所述的用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，其中用于翻译成蛋白质的真核生物可翻译元件包含病毒或非病毒真核生物细胞内部核糖体进入位点(IRES)元件。12.根据权利要求11所述的用于产生真核生物可翻译mRNA的系统，其中所述病毒或非病毒真核生物细胞内部核糖体进入位点(IRES)元件从蟋蟀麻痹病毒(CrPV)IRES、口蹄疫病毒(FMDV)IRES和猪瘟病毒(CSFV)IRES或表1
‑
3中列出的IRES组成的组中选择。13.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：西韦克生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：