【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌平台
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年6月01日提交的美国临时申请号62/856,055的权益。
[0003]本专利技术涉及使用非致病细菌递送平台将基因编辑系统递送至真核细胞。
技术介绍
[0004]基因编辑是一种形式的基因工程,其中在活生物体的基因组中插入、删除、修饰或替换DNA。基因组内的特定序列的编辑可用于研究目的,以及通过将突变靶向至特定基因或将功能基因插入生物体并将其靶向以替换与致病表型或遗传疾病相关的缺陷基因而用于基因治疗中。基因编辑的常见方法是使用工程化的核酸酶或合成核酸酶。一个实例是CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)/Cas或CRISPR/Cas系统,它正在迅速推进基因组编辑领域。
技术实现思路
[0005]本专利技术提供了一种细菌介导的基因编辑递送平台,其使用侵袭性的非致病细菌将包括但不限于CRISPR/Cas系统的基因编辑货物递送至真核细胞,其中所述细菌含有与编码基因编辑货物的原核表达盒相关的原核启动子。
[0006]在一个方面,本专利技术提供了一种用于产生和递送包括基于核酸酶的基因编辑系统的基因编辑系统至真核细胞的方法。所述方法包括用侵袭性的非致病细菌侵袭真核细胞的步骤。所述细菌含有qidongzi,所述质粒具有编码基因编辑系统的原核表达盒。原核表达盒可以在一个或多个原核启动子,例如T7、lacUV5、gapA、T5、recA、Ptac、Patac、pA1、lac、Sp6、 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,所述细菌包括经过工程改造以表达至少一种侵袭因子以有助于细菌进入真核细胞的细菌,其中所述细菌包含编码CRISPR相关(Cas)酶、核定位信号(NLS)、一个或多个CRISPR同向重复区域、一个或多个间隔序列和一个或多个tracr序列的质粒,并且其中所述质粒包含原核启动子以有助于经编码的基因编辑系统的一个或多个元件的转录。2.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述质粒编码多于一种CRISPR相关(Cas)酶。3.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中经编码的CRISPR相关(Cas)酶是Cas9基因。4.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述真核细胞是动物细胞。5.根据权利要求4所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述真核细胞是分裂细胞或非分裂细胞。6.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述侵袭因子由选自由inv、hlyA、HA
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1或其组合组成的组的基因编码。7.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌是来自由以下组成的细菌组的细菌:李斯特氏菌属(Listeria)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、立克次氏菌属(Rickettsia)、志贺氏菌属(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、军团菌属(Legionella)、衣原体属(Chlamydia)、布鲁氏菌属(Brucella)、奈瑟菌属(Neisseria)、伯克氏菌属(Burkolderia)、博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、科氏杆菌属(Coxiella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、弧菌属(Vibrio)、密螺旋体属(Treponema)、乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacteriae)。8.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌是大肠杆菌细菌。9.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌是选自由以下组成的组的细菌:艰难梭菌(Clostridium difficile)、大肠杆菌(Escherichia coli)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道炎加特纳菌(Gardnerella vaginitis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、放线共生放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结节型麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diptheriae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、B群链球菌(group B streptococci)、金黃葡萄球菌、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎
链球菌(Streptococcus pneumonia)、肠球菌属的物种(Enterococcus spp.)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、李斯特氏菌属、耶尔森氏菌属、立克次氏菌属、志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、军团菌属、衣原体属、布鲁氏菌属、奈瑟菌属、伯克氏菌属、博德特氏菌属、疏螺旋体属、科氏杆菌属、分枝杆菌属、螺杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、卟啉单胞菌属、弧菌属、密螺旋体属、乳杆菌属和双歧杆菌属。10.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述原核启动子是选自由T7、lacUV5、gapA、T5、recA、Ptac、Patac、pA1、lac、Sp6、araBad、trp或杂合启动子组成的组的启动子。11.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述侵袭因子是侵袭素蛋白和/或李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白。12.根据权利要求1所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述间隔序列能够与真核细胞中的靶序列杂交。13.一种用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,所述细菌包括经过工程改造以表达有助于细菌进入真核细胞的至少一种侵袭因子、CRISPR相关(Cas)酶、核定位信号(NLS)、一个或多个CRISPR同向重复区域、一个或多个间隔序列和一个或多个tracr序列的细菌。14.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中有助于细菌进入真核细胞的一种侵袭因子、所述CRISPR相关(Cas)酶、所述核定位信号(NLS)、所述一个或多个CRISPR同向重复区域、所述一个或多个间隔序列或所述一个或多个tracr序列中的一者或多者是从所述细菌的染色体中表达。15.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述CRISPR相关(Cas)酶是从所述细菌的染色体中表达。16.根据权利要求15所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌包含编码一个或多个CRISPR同向重复区域、一个或多个间隔序列和一个或多个tracr序列的质粒,并且其中所述质粒包含原核启动子以有助于所述一个或多个CRISPR同向重复区域、一个或多个间隔序列和一个或多个tracr序列的转录。17.根据权利要求16所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述原核启动子是选自由T7、lacUV5、gapA、T5、recA、Ptac、Patac、pA1、lac、Sp6、araBad、trp或杂合启动子组成的组的启动子。18.根据权利要求15所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌包含编码一个或多个间隔序列的质粒,并且其中所述质粒包含原核启动子以有助于所述一个或多个间隔序列的转录。19.根据权利要求18所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述原核启动子是选自由T7、lacUV5、gapA、T5、recA、Ptac、Patac、pA1、lac、Sp6、araBad、trp或杂合启动子组成的组的启动子。20.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中经编码的CRISPR相关(Cas)酶是Cas9基因。21.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中染色体编码多于一种CRISPR相关(Cas)酶。
22.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述侵袭因子是从所述细菌的染色体中表达。23.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述CRISPR相关(Cas)酶和所述侵袭因子是从所述细菌的染色体中表达。24.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述侵袭因子由选自由inv、hlyA、HA
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1或其组合组成的组的基因编码。25.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌是选自由以下组成的细菌组的细菌:李斯特氏菌属、耶尔森氏菌属、立克次氏菌属、志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、军团菌属、衣原体属、布鲁氏菌属、奈瑟菌属、伯克氏菌属、博德特氏菌属、疏螺旋体属、科氏杆菌属、分枝杆菌属、螺杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、卟啉单胞菌属、弧菌属、密螺旋体属、乳杆菌属和双歧杆菌属。26.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌是大肠杆菌细菌。27.根据权利要求13所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌是选自由以下组成的组的细菌:艰难梭菌、大肠杆菌、破伤风梭菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、阴道炎加特纳菌、牙龈卟啉单胞菌、放线共生放线杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、金黃葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、创伤弧菌、伤寒沙门氏菌、肉毒杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、结节型麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、变形链球菌、B群链球菌、金黃葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、肠球菌属的物种、粪肠球菌、李斯特氏菌属、耶尔森氏菌属、立克次氏菌属、志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、军团菌属、衣原体属、布鲁氏菌属、奈瑟菌属、伯克氏菌属、博德特氏菌属、疏螺旋体属、科氏杆菌属、分枝杆菌属、螺杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、卟啉单胞菌属、弧菌属、密螺旋体属、乳杆菌属和双歧杆菌属。28.一种用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,所述细菌包括经过工程改造以表达至少一种侵袭因子以有助于细菌进入真核细胞的细菌,其中所述细菌包含编码CRISPR相关(Cas)酶、核定位信号(NLS)、一个或多个CRISPR同向重复区域、一个或多个间隔序列和一个或多个tracr序列的质粒。29.根据权利要求28所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述质粒具有启动子并且所述启动子是真核启动子。30.根据权利要求29所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述真核启动子是选自由CMV、EF1a、CAG、PGK、TRE或U6启动子组成的组的启动子。31.一种用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,所述细菌包括经过工程改造以表达至少一种侵袭因子以有助于细菌进入真核细胞的细菌,其中所述细菌包含编码CRISPR相关(Cas)酶、一个或多个CRISPR同向重复区域、一个或多个间隔序列和一个或多个tracr序列的质粒,并且其中所述质粒包含原核启动子以有助于经编码的基因编辑系统的一个或多个元件的转录。32.根据权利要求31所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述原核启动子是选自由T7、lacUV5、gapA、T5、recA、Ptac、Patac、pA1、lac、Sp6、araBad、trp或杂合启动子组成的组的启动子。
33.根据权利要求31所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述侵袭因子是侵袭素蛋白和/或李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白。34.根据权利要求31所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述间隔序列能够与真核细胞中的靶序列杂交。35.根据权利要求31所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述CRISPR相关(Cas)酶具有核定位序列(NLS)。36.根据权利要求31所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述质粒编码多于一种CRISPR相关(Cas)酶。37.一种用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,所述细菌包括经过工程改造以表达至少一种侵袭因子有助于细菌进入真核细胞的细菌,并且其中所述细菌经过工程改造以表达用于编辑靶真核细胞基因组的基因编辑系统和用于控制所述基因编辑系统的转录的启动子。38.根据权利要求37所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述基因编辑系统是选自由以下组成的组的系统:CRISPR/Cas、效应物核酸酶、Tal
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效应物核酸酶(TALEN)、转录活化剂样效应物(TALE)、ARC核酸酶、锌指核酸酶、基于Argonaute系统的核酸酶、TtAgo核酸酶系统或其组合。39.根据权利要求37所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述侵袭因子和/或所述基因编辑系统的一个或多个元件是从所述细菌的染色体中表达。40.一种用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,所述细菌包括经过工程改造以表达至少一种侵袭因子以有助于细菌进入真核细胞的细菌,其中所述细菌包含编码所述基因编辑系统的质粒和用于控制所述基因编辑系统的转录的启动子。41.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述启动子是原核启动子。42.根据权利要求41所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述原核启动子是选自由T7、lacUV5、gapA、T5、recA、Ptac、Patac、pA1、lac、Sp6、araBad、trp或杂合启动子组成的组的启动子。43.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述基因编辑系统是基于核酸酶的基因编辑系统。44.根据权利要求43所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述基于核酸酶的基因编辑系统是选自由CRISPR/Cas、TALENs和锌指核酸酶组成的组的系统。45.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述真核细胞是动物细胞。46.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述真核细胞是分裂细胞或非分裂细胞。47.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述基因编辑系统是选自由以下组成的组的系统:CRISPR/Cas、效应物核酸酶、Tal
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效应物核酸酶(TALEN)、转录活化剂样效应物(TALE)、ARC核酸酶、锌指核酸酶、基于Argonaute系统的核酸酶、TtAgo核酸酶系统或其组合。48.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述质
粒编码核定位信号序列。49.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述侵袭因子由选自由inv、hlyA、HA
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1或其组合组成的组的基因编码。50.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌是选自由以下组成的细菌组的细菌:李斯特氏菌属、耶尔森氏菌属、立克次氏菌属、志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、军团菌属、衣原体属、布鲁氏菌属、奈瑟菌属、伯克氏菌属、博德特氏菌属、疏螺旋体属、科氏杆菌属、分枝杆菌属、螺杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、卟啉单胞菌属、弧菌属、密螺旋体属、乳杆菌属和双歧杆菌属。51.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌是大肠杆菌细菌。52.根据权利要求40所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,其中所述细菌是选自由以下组成的组的细菌:艰难梭菌、大肠杆菌、破伤风梭菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、阴道炎加特纳菌、牙龈卟啉单胞菌、放线共生放线杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、金黃葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、创伤弧菌、伤寒沙门氏菌、肉毒杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、结节型麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、变形链球菌、B群链球菌、包括但不限于金黃葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、肠球菌属的物种、包括但不限于粪肠球菌、李斯特氏菌属、耶尔森氏菌属、立克次氏菌属、志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、军团菌属、衣原体属、布鲁氏菌属、奈瑟菌属、伯克氏菌属、博德特氏菌属、疏螺旋体属、科氏杆菌属、分枝杆菌属、螺杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、卟啉单胞菌属、弧菌属、密螺旋体属、乳杆菌属和双歧杆菌属。53.根据权利要求1至52中任一项所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,用于医药或治疗中。54.根据权利要求1至52中任一项所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,用于预防或治疗疾病。55.根据权利要求1至52中任一项所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,用于研究应用中。56.根据权利要求1至52中任一项所述的用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌,用于在体外、体内和/或离体使用。57.一种用于制备用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌的试剂盒,所述试剂盒包含:细菌,其已经过工程改造以表达有助于细菌进入真核细胞的至少一种侵袭因子、CRISPR相关(Cas)酶、核定位信号(NLS)、一个或多个CRISPR同向重复区域和一个或多个tracr序列;和质粒,其编码一个或多个间隔序列和用于控制所述基因编辑系统的转录的启动子。58.根据权利要求57所述的用于制备用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌的试剂盒,其中所述启动子是原核启动子。59.根据权利要求58所述的用于制备用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌的试剂盒,其中所述原核启动子是选自由T7、lacUV5、gapA、T5、recA、Ptac、Patac、pA1、lac、Sp6、araBad、trp或杂合启动子组成的组的启动子。
60.根据权利要求57所述的用于制备用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌的试剂盒,其中所述侵袭因子由选自由inv、hlyA、HA
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1或其组合组成的组的基因编码。61.根据权利要求57所述的用于制备用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌的试剂盒,其中所述CRISPR相关(Cas)酶和/或所述侵袭因子是从所述细菌的染色体中表达。62.根据权利要求57所述的用于制备用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌的试剂盒,其中所述CRISPR相关(Cas)酶、所述一个或多个CRISPR同向重复区域和所述一个或多个tracr序列是从所述细菌的染色体中表达。63.根据权利要求57所述的用于制备用于将基因编辑系统递送至真核细胞的细菌的...
【专利技术属性】
技术研发人员:L,
申请(专利权)人:西韦克生物技术有限责任公司,
类型:发明
国别省市:
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