pBACS质粒载体构建方法及其在单片段至多片段无缝克隆中的应用技术

本发明专利技术涉及一种质粒pBACS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的质粒pBACS包括oriS复制子、oriV复制子、redF基因、sopC基因、sopB基因、sopA基因、repE基因、通用引物T7/T7

【技术实现步骤摘要】
pBACS质粒载体构建方法及其在单片段至多片段无缝克隆中的应用


[0001]本专利技术属于生物技术及基因工程
，涉及一种pBACS质粒载体构建方法及其在单片段至多片段无缝克隆中的应用。

技术介绍

[0002]质粒是一种存在于微生物细胞中，独立于染色体之外的，可进行自主复制的，共价闭合环状DNA分子，大小在1 kb到1000 kb之间。在基因工程中，质粒是目的基因的常用载体，广泛应用于基因克隆、测序及基因合成等领域。
[0003]根据质粒的复制特点，质粒被分为严紧型质粒和松弛型质粒两类。严紧型质粒也称为低拷贝质粒，菌体中的细胞数目有限；松弛型质粒也称高拷贝质粒，其拷贝数在单个细胞中可达数百个。质粒的拷贝数由质粒复制子调控，低拷贝质粒通常具有稳定性高、容量大质粒易于纯化等特点。
[0004]基因连接多利用限制性核酸内切酶和T4 DNA连接酶通过体外连接，该方法应用较早，存在明显的局限性。首先，操作步骤繁琐，不易找到合适的酶切位点；其次，连接效率较低，在后续的转化实验中由于载体自连问题易形成假阳性；此外，限制性内切酶和连接酶价格高，假阳性无法避免，不利于基因组装的高通量进行。与传统的酶切连接法相比，利用同源重组构建重组质粒的方法具有效率高、操作简便的天然优势。目前上市的大多数同源重组试剂盒都是采用从大肠杆菌中提取与重组相关的蛋白在体外进行重组，该方法虽弥补了酶切连接法的不足，但体外重组存在错配率高的问题；同时，现有重组方法使用的重组载体通常为高拷贝质粒，易导致质粒不纯、容量小、突变率高、质粒在复制过程中易丢失的问题。因此，如何克服上述实验方法的缺陷，提高基因重组效率是当今科研人员面临的重要问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对传统基因重组效率不够高的问题提出一种新型的高效、低拷贝、大容量、假阳性率低、传代复制不易丢失的用于基因克隆、基因测序、人工染色体构建及基因筛选的质粒载体pBACS及其构建方法与应用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术是采用下述的技术方案实现的：一种pBACS质粒，所述质粒包括oriS复制子、oriV复制子、redF基因、sopC基因、sopB基因、sopA基因、repE基因、抗生素抗性基因以及通用测序引物附着位点；所述的通用引物附着位点设置于多克隆位点两端。
[0007]优选的，所述的抗生素抗性基因为编码氨基糖苷磷酸转移酶的卡那霉素抗性基因。
[0008]优选的，所述质粒pBACS具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述质粒中，自5'端第1
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290 bp为复制子oriS；自5'端第291
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909 bp为复制子oriV；自5'端第1330
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1677 bp为基因redF；第2017
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2832位脱氧核糖核苷酸为卡那霉素抗性基因；自5'端第3549
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4022 bp为
基因sopC；自5'端第4095
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5066 bp为基因sopB；自5'端第5066
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6241 bp为基因sopA；自5'端第6820
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7575 bp为基因repE。
[0009]优选的，所述质粒pBACS，自5'端第2840
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2859 bp为通用型上游引物T7结合位点；自5'端第3139
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3157 bp为通用型下游引物T7
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Term结合位点。
[0010]优选的，所述质粒pBACS，自5'端第2860
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3152 bp为多克隆位点所在区域。
[0011]优选的，所述质粒的拷贝数为1
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2个。
[0012]一种构建质粒pBACS的方法，包括以下步骤：步骤一：分别设计并人工合成如SEQ ID NO.2所示序列结构的repE
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oriS
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oriV
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redF基因片段，如SEQ ID NO.3所示序列结构的卡那霉素抗性基因片段，如SEQ ID NO.4所示序列结构的多克隆位点及通用引物T7/T7
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Term附着位点基因序列，如SEQ ID NO.5所示序列结构的sopA
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sopB
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sopB基因片段；步骤二：运用多片段基因重组方法将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所述基因片段重组，最终得到环状质粒。
[0013]优选的，所述SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5基因片段之间具有50 bp的同源臂。
[0014]优选的，所述多片段基因重组方法为Red/ET同源重组方法。
[0015]上述方法构建得到的质粒pBACS。
[0016]优选的，所述质粒pBACS在长片段基因及不稳定序列中基因克隆、基因测序、人工染色体构建及基因筛选领域中的应用。
[0017]本专利技术的目的在于构建一种高效、低拷贝的质粒载体pBACS，并将其应用于目的基因克隆、测序过程中；包括但不限于利用该质粒连接多物种来源的基因扩增产物，并进一步公开其构建方法和在无缝克隆中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：1.本专利技术利用人工合成和Red/ET同源重组技术，获得了一种低拷贝质粒pBACS，在普通细胞中的的拷贝数为1个，在表达了TrfA蛋白的菌株中，可获得2个拷贝数。pBACS理论上可容纳0.1 kb
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300 kb的基因片段，容量较大；具有可供转化子筛选的卡那霉素抗性基因；具有两个质粒DNA复制子，可选择性诱导质粒拷贝数；具有多克隆位点，方便目的基因的插入；具有通用引物对T7/T7
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Term结合位点，有利于阳性菌落的快速PCR验证筛选及测序工作。
[0019]2.本专利技术的质粒pBACS具有拷贝数低、基因容量大、质粒在复制过程中不易丢失等特点，可用于多物种来源基因片段的克隆、筛选、测序及细菌人工染色体的构建等基因工程领域。利用质粒pBACS已成功构建出含有来自大肠杆菌、白色链霉菌和青霉菌保守序列的人工染色体，可用于目标基因序列的基因测序及基因保存。
附图说明
[0020]图1为质粒pBACS的构建流程模式图及其物理图谱。
[0021]图2为质粒pBACS使用NdeⅠ酶切结果；M,2kplus
ꢀⅡꢀ
DNA marker；1
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4：pBACS阳性质粒NdeⅠ酶切结果。
[0022]图3为质粒pBACS的PCR验证结果；M：2kplus
ꢀⅡꢀ
DNA marker；1：使用引物pBACS
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Kan
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F/T7
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Term
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pBACS以pBACS为模板获得的1323 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种质粒pBACS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述质粒pBACS，其特征在于，包括oriS复制子、oriV复制子、redF基因、sopC基因、sopB基因、sopA基因、repE基因、抗生素抗性基因、多克隆位点及通用引物T7/T7
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Term结合位点；所述通用引物T7/T7
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Term结合位点置于多克隆位点的两端。3.根据权利要求2所述质粒pBACS，其特征在于，所述的抗生素抗性基因为编码氨基糖苷磷酸转移酶的卡那霉素抗性基因。4.根据权利要求3所述质粒pBACS，其特征在于，所述质粒的拷贝数为1
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2。5.根据权利要求4所述质粒pBACS，其特征在于，质粒核苷酸序列自5'端第1
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290 bp为复制子oriS；自5'端第291
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909 bp为复制子oriV；自5'端第1330
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1677 bp为redF基因；自5'端第2017
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2832位为卡那霉素抗性基因；自5'端第3549
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4022 bp为sopC基因；自5'端第4095
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5066 bp为sopB基因；自5'端第5066
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6241 bp为sopA基因；自5'端第6820
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7575 bp为repE基因；5'端第2840
‑
2859 bp为通用引物T7结合位点；自5'端第3139
‑
3157 bp为通用引物T...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯少阳，李岚芳，陈延宁，禚惠荣，张大虎，徐蕊，王新潮，樊兆斌，王娟，
申请(专利权)人：菏泽学院，
类型：发明
国别省市：