乙醇酸的生产方法技术

本发明专利技术公开了乙醇酸的生产方法。本发明专利技术提供了一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，包括使受体菌表达3

【技术实现步骤摘要】
乙醇酸的生产方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种乙醇酸的生产方法。

技术介绍

[0002]乙醇酸(glycolate,glycolic acid)又称为羟基乙酸(hydroxyacetic acid)，甘醇酸，分子式为C2H4O3，含有一个羟基和一个羧基，兼有醇和酸的双重性质。在化学清洗，生物降解，日用化工，纺织工业等行业得到了普遍的应用。
[0003]国外主要的生产厂家有美国杜邦公司(Dupont)，美国联合碳化合物公司(UCC)，德国赫可特公司(Hoechst)，日本丸和公司(Midori Kagaku)等。国内主要厂家有北京化工厂、靖江宏泰化工有限公司，河北诚信有限公司等十多家。目前国际市场的年需求量约为20万吨。乙醇酸全球市场价值在2011年为9300万美元，据估计，该数字到2018年将会增加到2亿300万美元。因此，乙醇酸具有极为重要的市场价值和开发潜力。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种乙醇酸的生产方法。
[0005]第一方面，本专利技术要求保护一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法。
[0006]本专利技术要求保护的构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，可包括使受体菌表达3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC的步骤。所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。
[0007]进一步地，所述方法还可包括对所述受体菌进行如下改造的步骤：抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达、抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达、和/或表达乙醛酸还原酶YcdW。
[0008]具体而言，本专利技术所要求保护的构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，可包括如下步骤(A1)：
[0009](A1)使受体菌表达3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制内源3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，所得菌株命名为工程菌1(对应NZ
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G400)；所述工程菌1为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。
[0010]进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A2)：
[0011](A2)以所述工程菌1为出发菌株，抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达，所得菌株命名为工程菌2(对应NZ
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G416)；所述工程菌2为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
[0012]更进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A3)：
[0013](A3)以所述工程菌2为出发菌株，抑制其内源苹果酸合酶AceB、乙醇酸脱氢酶AdhE、醛脱氢酶AldA、乳酸脱氢酶LdhA、甲基已二醛合酶MgsA、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta、丙酮酸氧化酶PoxB的表达，所得菌株命名为工程菌3(对应NZ
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G426)；所述工程菌3为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
[0014]再进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A4)：
[0015](A4)以所述工程菌3为出发菌株，表达T7 RNA聚合酶并抑制内源鼠李糖降解途径
酶RhaBAD的表达，将T7启动子整合于基因组中乙醛酸还原酶YcdW编码基因(即ycdW基因)的起始密码子前，表达乙醛酸还原酶YcdW并抑制内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的表达，抑制内源DNA结合转录阻遏物IclR的表达，增强内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因(即aceA基因)的表达，所得菌株命名为工程菌4(对应NZ
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G456)；所述工程菌4为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
[0016]又进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A5)：
[0017](A5)以所述工程菌4为出发菌株，抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达，所得菌株命名为工程菌5(对应NZ
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G466)；所述工程菌5为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
[0018]在所述步骤(A1)中，使所述受体菌表达所述3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制所述内源3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，可通过如下实现：用所述3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC的编码基因(即gapC基因)替换所述受体菌基因组中所述内源3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapA的编码基因(即gapA基因)。进一步地，可通过同源重组实现。
[0019]在本专利技术的具体实施方式中，所述3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC为源于丙酮丁酸梭菌的3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC。
[0020]所述步骤(A2)可为：以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的异柠檬酸脱氢酶ICDH的编码基因(即icdA基因)，所得菌株即为所述工程菌2(对应NZ
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G416)。
[0021]所述步骤(A3)可为：以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中的苹果酸合酶AceB的编码基因(即aceB基因)、乙醇酸脱氢酶AdhE的编码基因(即glcDEF基因)、醛脱氢酶AldA的编码基因(即aldA基因)、乳酸脱氢酶LdhA的编码基因(即ldhA基因)、甲基已二醛合酶MgsA的编码基因(即mgsA基因)、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta的编码基因(即ackA
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pta基因)、丙酮酸氧化酶PoxB的编码基因(即poxB基因)，所得菌株即为所述工程菌3(对应NZ
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G426)。
[0022]在所述步骤(A4)中，表达所述T7 RNA聚合酶并抑制所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的表达，可通过如下实现：将所述T7 RNA聚合酶的编码基因的表达盒整合到基因组中所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的编码基因(即rhaBAD基因)位置处。所述T7 RNA聚合酶的编码基因的表达盒中启动所述T7 RNA聚合酶的编码基因转录的启动子为Ptrc启动子。进一步地，可通过同源重组实现。其中，所述T7 RNA聚合酶为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的T7 RNA聚合酶。
[0023]在所述步骤(A4)中，表达所述乙醛酸还原酶YcdW并抑制所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的表达，可通过如下实现：将所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因(即ycdW基因)的表达盒整合到基因组中所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的编码基因(即araBAD基因)位置处。进一步地，所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因的表达盒中启动所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因转录的启动子为T7启动子。进一步地，可通过同源重组实现。其中，所述乙醛酸还原酶YcdW为内源乙醛酸还原酶YcdW。
[0024]在所述步骤(A4)中，抑制所述内源DNA结合转录阻遏物IclR的表达，可通过如下实现：敲除基因组中的所述DNA结合转录阻遏物IclR的编码基因(即iclR基因)。
[0025]在所述步骤(A4)中，增强所述内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因表达是通过如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，包括使受体菌表达3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC的步骤；进一步地，所述方法还包括对所述受体菌进行如下改造的步骤：抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达、抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达、和/或表达乙醛酸还原酶YcdW；所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。2.一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，包括如下步骤(A1)：(A1)使受体菌表达3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制内源3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株；所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A2)：(A2)以所述工程菌1为出发菌株，抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达，所得菌株命名为工程菌2；所述工程菌2为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A3)：(A3)以所述工程菌2为出发菌株，抑制其内源苹果酸合酶AceB、乙醇酸脱氢酶AdhE、醛脱氢酶AldA、乳酸脱氢酶LdhA、甲基已二醛合酶MgsA、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta、丙酮酸氧化酶PoxB的表达，所得菌株命名为工程菌3；所述工程菌3为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A4)：(A4)以所述工程菌3为出发菌株，表达T7 RNA聚合酶并抑制内源鼠李糖降解途径酶RhaBAD的表达，将T7启动子整合于基因组中乙醛酸还原酶YcdW编码基因的起始密码子前，表达乙醛酸还原酶YcdW并抑制内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的表达，抑制内源DNA结合转录阻遏物IclR的表达，增强内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因的表达，所得菌株命名为工程菌4；所述工程菌4为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A5)：(A5)以所述工程菌4为出发菌株，抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达，所得菌株命名为工程菌5；所述工程菌5为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。7.根据权利要求2
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6中任一所述的方法，其特征在于：在所述步骤(A1)中，使所述受体菌表达所述3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制所述内源3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，通过如下实现：用所述3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC的编码基因替换所述受体菌基因组中所述内源3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapA的编码基因；进一步地，所述3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC为源于丙酮丁酸梭菌的3
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磷酸甘油醛脱氢酶GapC；和/或所述步骤(A2)为：以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的异柠檬酸脱氢酶ICDH的编码基因，所得菌株即为所述工程菌2；和/或所述步骤(A3)为：以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中的苹果酸合酶AceB的编码基因、乙醇酸脱氢酶AdhE的编码基因、醛脱氢酶AldA的编码基因、乳酸脱氢酶LdhA的编码基因、甲基已二醛合酶MgsA的编码基因、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta的编码基因、丙酮
酸氧化酶PoxB的编码基因，所得菌株即为所述工程菌3；和/或在所述步骤(A4)中，表达所述T7 RNA聚合酶并抑制所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的表达，通过如下实现：将所述T7 RNA聚合酶的编码基因的表达盒整合到基因组中所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的编码基因位置处；进一步地，所述T7 RNA聚合酶的编码基因的表达盒中启动所述T7 RNA聚合酶的编码基因转录的启动子为Ptrc启动子；和/或进一步地，所述T7 RNA聚合酶为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的T7 RNA聚合酶；和/或在所述步骤(A4)中，表达所述乙醛酸还原酶YcdW并抑制所述内源阿拉伯糖降解...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，朱欣娜，徐洪涛，朱彤，仇焕娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：