一种幽门螺杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种幽门螺杆菌

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种定植于胃上皮细胞的革兰氏阴性细菌，可引起胃炎、消化性溃疡病、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃腺癌等疾病。虽然感染是慢性的并且通常无症状，但这种细菌感染了世界上超过50％的人口，已被世界卫生组织认定为I类致癌物。
[0004]目前利用绿色荧光蛋白标记幽门螺杆菌，研究遗传调控的载体非常有限。第一代载体如pHel2，Heuermann&Haas(1998)年设计，是一种可在大肠杆菌
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幽门螺杆菌中穿梭的表达载体。该载体元件包括大肠杆菌复制起始序列、幽门螺杆菌特异性复制起始序列、oriT和多克隆位点。该载体以绿色荧光蛋白作为报告基因，同时携带氯霉素、卡那霉素抗性基因。但氯霉素和卡那霉素均有较强的细胞毒性，同时pHel载体与细菌染色体同源区段较多，易被整合细菌染色体中，传代稳定性较差。
[0005]第二代载体pTM117由Beth M.C.等人(2007)年设计出来，该载体由幽门螺杆菌内源性质粒(pHP666(45))添加大肠杆菌复制起点、卡那霉素抗性盒、多克隆位点和一个无启动子的绿色荧光蛋白突变基因(gfpmut3)构成。但该载体结构较为简单，且绿色荧光蛋白的荧光较弱，当幽门螺杆菌进入宿主细胞后不易被检测到。由于相对缺乏研究这种细菌的遗传操作工具，对幽门螺杆菌的研究在一定程度上受到了限制。

技术实现思路

[0006]针对目前现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用。本专利技术将表达高亮度荧光蛋白(AausFP1)的基因用作转录报告基因，通过全基因合成优化设计的质粒元件，并利用双酶切整合到pCDFDuet
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1载体上，从而成功构建获得一种幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体，该表达载体具有良好的传代稳定性，且能够使得外源基因在该载体相关元件控制下，在大肠杆菌和幽门螺杆菌中表达，因此具有良好的实际应用之价值。
[0007]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体，所述穿梭表达载体其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0009]具体的，所述穿梭表达载体包括如下元件：大肠杆菌及幽门螺杆菌的复制起点编
码序列、青霉素和链霉素双抗性盒基因、分子伴侣基因(co
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chaperonin groES)的转录起始区和启动子，以及高亮绿色荧光蛋白(AausFP1)报告基因。
[0010]本专利技术的又一具体实施方式中，所述穿梭表达载体选用pCDFDuet
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1载体作为骨架载体改造而来。
[0011]本专利技术的第二个方面，提供上述幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体的构建方法，所述构建方法包括：
[0012]将基于幽门螺杆菌密码子使用偏好优化的绿色荧光蛋白(AausFP1)、青霉素和链霉素双抗性盒、复制起点、启动子、转录起始位点、核糖体结合位点全基因合成，并整合成一个片段，使用双酶切的方法连接到pCDFDuet
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1载体上，将基于大肠杆菌密码子使用偏好优化的绿色荧光蛋白(AausFP1)通过双酶切的方法连接到质粒pCDFDuet
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1上获得。
[0013]本专利技术的第三个方面，提供上述幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体在如下任意一种或多种中的应用：
[0014]1)外源基因在幽门螺杆菌中的表达；
[0015]2)外源基因在大肠杆菌中的表达；
[0016]3)幽门螺杆菌和/或大肠杆菌的遗传调控研究；
[0017]4)幽门螺杆菌和/或大肠杆菌相关药物研发。
[0018]上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
[0019]上述技术方案提供一种幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用。本专利技术将高亮度荧光蛋白用作转录报告基因，并通过添加大肠杆菌、幽门螺杆菌的复制起点、青霉素和链霉素双抗性盒、以及转录起始区和启动子从而成功构建获得一种幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体，该表达载体具有良好的传代稳定性，且能够使得外源基因在该载体相关元件控制下，在大肠杆菌和幽门螺杆菌中表达，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
[0020]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0021]图1为本专利技术幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体骨架图；
[0022]图2为本专利技术实施例中荧光显微镜观察DH5α大肠杆菌图；
[0023]图3为本专利技术实施例中荧光显微镜观察幽门螺杆菌图；
[0024]图4为本专利技术实施例中大肠杆菌划线传代第4代平板图；
[0025]图5为本专利技术实施例中幽门螺杆菌第4代涂布平板图。
具体实施方式
[0026]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0027]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0028]现结合具体实例对本专利技术作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]本专利技术的一个典型具体实施方式中，提供一种幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体，所述穿梭表达载体其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0030]具体的，所述穿梭表达载体包括如下元件：大肠杆菌及幽门螺杆菌的复制起点编码序列、青霉素和链霉素双抗性盒基因、分子伴侣基因(co
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chaperonin groES)的转录起始区和启动子，以及高亮绿色荧光蛋白(AausFP1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于，所述穿梭表达载体其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的穿梭表达载体，其特征在于，所述穿梭表达载体包括如下元件：大肠杆菌及幽门螺杆菌的复制起点编码序列、青霉素和链霉素双抗性盒基因、分子伴侣基因的转录起始区和启动子，以及高亮绿色荧光蛋白报告基因。3.如权利要求1所述的穿梭表达载体，其特征在于，所述穿梭表达载体选用pCDFDuet
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1载体作为骨架改造而来。4.如权利要求1所述的穿梭表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌的复制起点编码序列采用CloDF13 ori复制子基因。5.如权利要求1所述的穿梭表达载体，其特征在于，所述幽门螺杆菌的复制起点编码序列采用幽门螺杆菌天然质粒的序列，从而可实现在幽门螺杆菌中自我复制优选的，采用天然质粒ACCESSION DQ198799；Helicobacter pylori strain CCUG 17874plasmid pHP666。6.权利要求1
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5任一项所述幽门螺杆菌
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大肠杆菌穿梭表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：S1、基于大肠杆菌密码子偏好优化的绿色荧光蛋白(AausFP1)，用于在大肠杆菌中表达；全基因合成后，利用bgl II和Kpn I两个酶切位点连到pCDFDuet
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1载体上；其序列如SEQ ID NO.2所示；S2、氨苄青霉素抗性表...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明义，孔令明，丛海燕，
申请(专利权)人：威海市立医院，
类型：发明
国别省市：