p53的重组表达载体的获取方法技术

本公开是关于一种p53的重组表达载体的获取方法。该方法包括：获取至少三个包括不同终止密码子的重组花绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒；对所述至少三个包括不同终止密码子的重组花绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒进行双酶切和酶连反应，获取至少三个p53的重组表达载体。该技术方案通过对重组花绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒进行双酶切和酶连反应，获取的p53的重组表达载体包括p53的特征片段，可以根据该六组重组表达载体对p53的特性进行进一步的研究，为日后的研究提供基础和便利。研究提供基础和便利。研究提供基础和便利。

【技术实现步骤摘要】
p53的重组表达载体的获取方法


[0001]本公开涉及分子生物学
，尤其涉及一种p53的重组表达载体的 获取方法。

技术介绍

[0002]花绒寄甲(Dastarcus helophoroides Fairmaire)是天牛等大中型林木蛀干 害虫重要的寄生性天敌昆虫，因其“长寿”、适应性强、分布广、防治范围广、 有效期强等特点，在林木类蛀干害虫的防治中受到广泛地研究与应用。
[0003]相关技术中，p53作为一种抑癌基因，是动物体内重要的转录调控因子， 在各大调控途径中发挥着重要作用，花绒寄甲细胞肿瘤抗原p53(Cellulartumor antigen p53)是p53的同源基因，参与细胞凋亡途径，与其生理及衰老 机制密切相关，通过对花绒寄甲p53基因的研究，能为花绒寄甲的“长寿”机 制的研究提供重要的信息。

技术实现思路

[0004]为克服相关技术中存在的问题，本公开实施例提供一种p53的重组表达 载体的获取方法。所述技术方案如下：
[0005]根据本公开实施例提供一种p53的重组表达载体的获取方法，其特征在 于，包括：
[0006]获取至少三个包括不同终止密码子的重组花绒寄甲p53基因的编码区片 段的T载体质粒；
[0007]对所述至少三个包括不同终止密码子的重组花绒寄甲p53基因的编码区 片段的T载体质粒进行双酶切和酶连反应，获取至少三个p53的重组表达载 体。
[0008]在一个实施例中，所述对所述至少三个包括不同终止密码子的重组花绒 寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒进行双酶切和酶连反应，获取至少 三个p53的重组表达载体包括：
[0009]采用限制性内切酶HindIII和SacI对所述至少三个包括不同终止密码子 的重组花绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒进行双酶切，获取分别 对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物；
[0010]将所述对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物与至少两个载体进行 连接，获取与所述T载体质粒的数量以及所述载体数量匹配的多个p53的重 组表达载体。
[0011]在一个实施例中，所述将所述对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产 物与至少两个载体进行连接包括：
[0012]将所述对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物与线性化的表达载体 pET28a(+)和pSUMO进行连接。
[0013]在一个实施例中，所述将所述对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产 物与线性化的表达载体pET28a(+)和pSUMO进行连接包括：
[0014]采用T4DNA连接酶将所述对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物 与线性化的
表达载体pET28a(+)和pSUMO进行连接。
[0015]在一个实施例中，所述至少三个包括不同终止密码子的重组花绒寄甲 p53基因的编码区片段的T载体质粒包括T
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p53
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NR1，T
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p53
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NR2，T
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p53
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NR3；
[0016]所述采用限制性内切酶HindIII和SacI对所述至少三个包括不同终止密 码子的重组花绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒进行双酶切，获取 分别对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物包括：
[0017]选择NEB的限制性内切酶HindIII和SacI，将T载体质粒T
‑
p53
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NR1， T
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p53
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NR2，T
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p53
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NR3以及载体pET
‑
28a(+)和pSUMO在37℃的环境下 双酶切1小时。
[0018]本公开的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：通过对重组花 绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒进行双酶切和酶连反应，获取的 p53的重组表达载体包括p53的特征片段，可以根据该六组重组表达载体对 p53的特性进行进一步的研究，为日后的研究提供基础和便利。
[0019]应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性 的，并不能限制本公开。
附图说明
[0020]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公 开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
[0021]图1是根据一示例性实施例示出的p53的重组表达载体的获取方法的流 程图。
[0022]图2是根据一示例性实施例示出的p53的重组表达载体的表达蛋白的条 带位置示意图。
具体实施方式
[0023]这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的 描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的 要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所 有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一 些方面相一致的装置和方法的例子。
[0024]本公开实施例提供一种p53的重组表达载体的获取方法，如图1所示， 该获取方法包括以下步骤101至步骤115：
[0025]在步骤101中，获取包括花绒寄甲的总RNA(Ribonucleic Acid，核糖核 酸)的第一产物。
[0026]采用RNA柱式提取试剂盒，按照其说明书进行花绒寄甲成虫总RNA的 提取，获取包括上述总RNA的第一产物。
[0027]若该RNA在提取的过程中出现降解，可能会影响最终的试验结果，因 此在获取到总RNA之后可以采用核酸检测仪对所抽提RNA的浓度进行检测， 在加有核酸染色剂的1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳液可以为1
×
TAE 电泳缓冲液，电泳条件为：120V，25
‑
35min，根据电泳检测所得到的RNA 条带情况确定所得到RNA是否降解。
[0028]具体的，本实验采用的花绒寄甲由西北农林科技大学林学院森林害虫生 物控制实验室饲养盒提供，饲养温度为(25
±
1)℃，相对湿度(RH)为70％
‑
80％ (李小辉等，2019；
ZHANGet.al；2014)。
[0029]在步骤102中，合成花绒寄甲的cDNA(Complementary DNA，互补DNA) 第一链作为第二产物。
[0030]根据反转录试剂盒进行花绒寄甲第一链cDNA合成，所有步骤均在冰上 进行，以防止反转录过程中RNA降解，实验所用PCR管为实验用无酶无菌 PCR管。
[0031]具体的，合成步骤分为两步：
[0032]第一步，去除包括总RNA的第一产物中的基因组DNA(gDNA，genomicDNA)。
[0033]具体的，该基因组DNA去除体系反应混合液配置如下：
[0034][0035][0036]将上述各成分按比例配置之后轻轻混匀，并在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种p53的重组表达载体的获取方法，其特征在于，包括：获取至少三个包括不同终止密码子的重组花绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒；对所述至少三个包括不同终止密码子的重组花绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒进行双酶切和酶连反应，获取至少三个p53的重组表达载体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述至少三个包括不同终止密码子的重组花绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒进行双酶切和酶连反应，获取至少三个p53的重组表达载体包括：采用限制性内切酶HindIII和SacI对所述至少三个包括不同终止密码子的重组花绒寄甲p53基因的编码区片段的T载体质粒进行双酶切，获取分别对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物；将所述对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物与至少两个载体进行连接，获取与所述T载体质粒的数量以及所述载体数量匹配的多个p53的重组表达载体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述将所述对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物与至少两个载体进行连接包括：将所述对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物与线性化的表达载体pET28a(+)和pSUMO进行连接。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述将所述对应所述至少三个T载体质粒的双酶切产物与线性化的表达载体pET2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李菲菲，李孟楼，唐光辉，泰亚卜，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：