一种体液免疫系统再生的方法及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种体液免疫系统再生的方法及其应用。所述方法中多能干细胞表达RUNX1基因、HOXA9基因和LHX2基因，在体外诱导分化后可高效获得B细胞种子，移植后可以在体液免疫系统缺失的动物体内再生完备的体液免疫系统，是一种高效的体液免疫系统再生的方法，能够实现抗原特异性抗体免疫应答，针对抗原产生特异性高亲和力抗体，并产生免疫记忆。同时，所述方法重建的免疫系统安全，未见致瘤性风险。未见致瘤性风险。未见致瘤性风险。

【技术实现步骤摘要】
一种体液免疫系统再生的方法及其应用


[0001]本专利技术属于医药生物工程
，涉及多能干细胞的定向分化，尤其涉及一种体液免疫系统再生，即多能干细胞定向分化B细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]B细胞是体液免疫系统的核心细胞成分，B细胞功能缺陷会导致病人体液免疫下降，甚至出现严重的细菌、病毒或其他病原微生物的感染。所以，通过再生手段恢复甚至增强体液免疫系统，有望造福众多体液免疫系统异常的患者。
[0003]多能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)是一类具有无限增殖潜能、能分化产生不同谱系细胞潜力、方便进行基因编辑修饰的细胞，是细胞疗法再生医学研究的热点。诱导患者自体体细胞重编程衍生的多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)分化形成不同的谱系细胞，不但可以规避使用胚胎干细胞的伦理争议，而且降低了异基因免疫排斥的风险，成为再生医学领域的理想细胞开发材料。
[0004]如何诱导多能干细胞分化产生B谱系种子，移植后重建体液免疫系统，是全世界研究的热点和难点，迄今没有实质性突破，更没有临床转化的案例。
[0005]研究表明，人胚胎多能干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外与基质细胞共培养后更容易诱导产生NK细胞而不是B细胞(参见Martin,Colin H et al.Differences in lymphocyte developmental potential between human embryonic stem cell and umbilical cord blood
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derived hematopoietic progenitor cells.Blood vol.112,7(2008):2730
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7)。
[0006]小鼠诱导多能干细胞在体外与基质细胞共培养可以诱导出T细胞，却很难诱导出B细胞(参见Wada,Haruka et al.Successful differentiation to T cells,but unsuccessful B
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cell generation,from B
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cell
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derived induced pluripotent stem cells.International immunology vol.23,1(2011):65
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74)。
[0007]同时，关于体内B细胞重建的研究方法也很少，其中有研究表明体外ESC诱导的pro/pre
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B祖细胞移植入免疫缺陷鼠后可以产生B1和B2细胞，但是上述研究产生的B细胞在体内存在的时间很短暂，同时在移植后6
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8周就检测不到分泌的抗体(参见Potocnik,A J et al.Reconstitution of B cell subsets in Rag deficient mice by transplantation of in vitro differentiated embryonic stem cells.Immunology letters vol.57,1
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3(1997):131
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7)。还有研究报道ESC在体外可以诱导出B1细胞的祖细胞，移植入免疫缺陷小鼠的体内可以长期重建B1细胞(参见Lin,Yang et al.Long
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Term Engraftment of ESC
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Derived B
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1Progenitor Cells Supports HSC
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Independent Lymphopoiesis.Stem cell reports vol.12,3(2019):572
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583)，但是此方法却不能获得对适应性体液免疫应答更重要的B2细胞。
[0008]此外，还有研究通过在多能干细胞中表达特定的转录因子获得具有多谱系造血重建能力的造血干组细胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs)，移植后可
以产生包括B细胞在内的多个造血谱系细胞(参见Lu,Yi
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Fen et al.Engineered Murine HSCs Reconstitute Multi
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lineage Hematopoiesis and Adaptive Immunity.Cell reports vol.17,12(2016):3178
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3192；和Sugimura,Ryohichi et al.Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.Nature vol.545,7655(2017):432
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438)，但上述研究体系存在稳定性差、效率较低的问题。
[0009]因此，本领域亟需一种高效的诱导多能干细胞获得单一B谱系种子细胞的方法。

技术实现思路

[0010]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种多能干细胞定向分化B细胞的方法及其应用，采用基因修饰的多能干细胞，在体外诱导分化高效获得B细胞种子，移植后可以在体液免疫系统缺失的动物体内再生完备的体液免疫系统，是一种高效的体液免疫系统再生的方法，能够实现抗原特异性抗体免疫应答，针对抗原产生特异性高亲和力抗体，并产生免疫记忆，该方法重建的免疫系统安全，未见致瘤性风险。
[0011]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0012]第一方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体含有编码RUNX1，HOXA9和LHX2基因的核苷酸序列，用于实现RUNX1，HOXA9以及LHX2三个基因的串联共表达。
[0013]本专利技术中，将RUNX1、HOXA9和LHX2的cDNA序列串联表达于同一载体，并整合入哺乳动物多能干细胞基因组中，可以得到稳定表达RUNX1，HOXA9和LHX2的宿主细胞，操作简便、效率较高，得到的宿主细胞具有分化为B细胞的能力。
[0014]其中，RUNX1基因又称为AML1，是RUNX转录因子蛋白家族中的成员之一，是白血病染色体易位最常见的靶位点。RUNX1是十分关键的造血调控转录因子，其在内皮生血转化、原始造血、永久造血以及淋巴细胞生成中起着重要的作用；
[0015]所述RUNX1基因可以为多种来源，如人源或鼠源，其中，小鼠来源的RUNX1基因可以是ENSMUSG00000022952，人源来源的RUNX1基因可以是ENSG00000159216。
[0016]HOXA9基因是HOX基因家族的一员，是编码序列特异性转录调控因子，在胚胎发育以及造血调控方面起着重要作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有编码RUNX1基因、HOXA9基因和LHX2基因的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述编码RUNX1基因、HOXA9基因和LHX2基因的核苷酸序列采用编码2A肽的核苷酸序列进行串联连接；优选地，所述2A肽包括T2A、P2A、E2A或F2A中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述表达载体上，编码RUNX1基因的核苷酸序列、编码HOXA9基因的核苷酸序列和编码LHX2基因的核苷酸序列顺次连接，且所述编码RUNX1基因的核苷酸序列和编码HOXA9基因的核苷酸序列之间采用P2A核苷酸序列进行连接，所述编码HOXA9基因的核苷酸序列和编码LHX2基因的核苷酸序列之间采用T2A核苷酸序列进行连接。3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求1或2所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为多能干细胞，包括诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系；优选地，所述多能干细胞包括基因编辑后的诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系。4.一种体液免疫系统再生的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将如权利要求1或2所述的表达载体整合到多能干细胞中，并进行抗性克隆化筛选；(2)将步骤(1)所得的多能干细胞定向分化为诱导生血内皮；(3)将步骤(2)所述诱导生血内皮与骨髓基质细胞共培养，得到B谱系种子细胞；(4)将步骤(3)所述B谱系种子细胞转至动物模型中，分化产生B细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将所述表达载体整合到多能干细胞的位点包括ROSA26位点、AAVS1位点、CCR5位点、H11位点、COL1A1位点或TIGRE位点；优选地，步骤(1)所述整合的方法包括同源重组、CRISPR/Cas9、TALEN、转染或病毒感染中的任意一种或至少两种的组合，优选为同源重组；优选地，步骤(1)所述抗性筛选采用潮霉素B；优选地，步骤(2)所述定向分化的方法为：依次采用D0培养基、D2.5培养基和D6培养基培养所述多能干细胞，得到所述诱导生血内皮；优选地，步骤(3)所述骨髓基质细胞包括OP9
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DL1细胞、OP9
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DL4细胞、OP9细胞、MS5细胞、MS5
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DL1细胞、MS5
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DL4细胞、HS
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5细胞、HS
‑5‑
DL1细胞、HS
‑5‑
DL4细胞、MSC细胞、MSC
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DL1细胞、MSC
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DL4细胞中的任意一种或至少两种的组合；优选地，步骤(3)所述共培养的过程中采用强力霉素进行诱导；优选地，步骤(3)所述共培养的方法为：将所述诱导生血内皮与OP9
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DL1细胞采用D11培养基进行共培养，得到所述B谱系种子细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，优选地，所述D0培养基为含有3～8ng/mL骨形态发...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金勇，张琪，吴冰燕，胡房晓，翁启童，彭欢，王瑶，刘丽娟，刘晓飞，夏成祥，耿阳，吴红玲，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：