一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：引物设计、基因扩增和构建质粒、病毒拯救、病毒拯救鉴定、鉴定结果。本发明专利技术能够构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆并能成功拯救出病毒。病毒。病毒。

【技术实现步骤摘要】
一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及到一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法。

技术介绍

[0002]牛白血病病毒(Bovine leukemia virus，BLV)属于反转录病毒科(Retroviridae)，丁型反转录病毒属(Deltaretrovims)，其基因组长度约为8.7kb。病毒基因组包括两端的长末端重复序列LTRs，结构基因gag，pro，pol，env以及非结构基因tax，rex，G4，R3，AS。结构蛋白gp51(env)和p24(gag)是病毒活跃复制的指标，由于它们是主要的抗原蛋白，通常被用于血清学诊断。该病毒的感染会引起牛淋巴细胞持续性增生(persistentlymphocytosis，PL)，从而导致牛地方流行性白血病(enzooticbovine leukosis，EBL)。迄今为止，国内外研究人员对BLV在病毒生物学特性、致病机理、诊断方法和疫苗研究等方面做了一些工作。但是，目前仍然缺乏有效的防控手段并且国内未有关于构建牛白血病病毒全长感染性克隆的报道。因此，构建牛白血病病毒全长感染性克隆，有利于深入开展病毒的分子生物学特性、复制机制、致病机理等研究，有利于我们全面透彻的了解BLV，从而为开发高效的BLV诊断试剂和疫苗提供理论依据。

技术实现思路

[0003]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0004]鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
[0005]因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法，其包括如下步骤：
[0007]引物设计：根据目标菌株基因组序列设计引物；
[0008]基因扩增和构建质粒：使用引物对于目标基因进行PCR扩增；
[0009]病毒拯救：培养细胞，转染，然后进行传代，熔融后每一代做IF，观察增值情况；
[0010]病毒拯救鉴定：进行合胞体观测、遗传稳定性分析，抗原检测，逆转录酶活性测定；
[0011]鉴定结果：观测病毒拯救鉴定结果。
[0012]作为本专利技术所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：引物设计中，所述引物针对的为BLV毒株全基因组序列。
[0013]作为本专利技术所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：引物设计中，得到的引物包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8。
[0014]作为本专利技术所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：基因扩增和构建质粒中，所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2配合扩增基因A，所述SEQ ID No.3、SEQ ID No.4配合扩增基因B，SEQ ID No.5、SEQ ID No.6配合扩增基因C，SEQ ID No.7、SEQ ID No.8配合扩增基因D。
[0015]作为本专利技术所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：基因扩增和构建质粒中，使用PCR进行基因扩增，所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所扩增的目的基因与所述SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所扩增的目的基因进行融合PCR。
[0016]作为本专利技术所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：基因扩增和构建质粒中，使用PCR进行基因扩增，所述SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所扩增的目的基因与所述SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所扩增的目的基因进行融合PCR。
[0017]作为本专利技术所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：病毒拯救中，使用的培养基为加入2mL的含10％的胎牛血清的DMEM培养基。
[0018]作为本专利技术所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：病毒拯救时，进行传代培养，每代选取一半细胞进行3次冻融，每间隔一代做一次IF检测病毒繁殖情况。
[0019]作为本专利技术所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：病毒拯救鉴定包括遗传稳定性分析，传代13次后，采用IF与RT
‑
PCR检测遗传稳定性。
[0020]作为本专利技术所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法的一种优选方案，其中：病毒拯救鉴定包括逆转录酶活性测定，所述逆转录酶活性测定包括转染，转染完成培养，手机培养细胞冻融3次，离心，取上清液过滤，然后再进行超速离心，重悬备用。
[0021]本专利技术提供了前述的引物或者前述的制备方法在制备BLV诊断实际和/或疫苗中的应用，以及前述的制备方法制备的牛白血病病毒全长感染性克隆。本专利技术能够构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆并能成功拯救出病毒。本专利技术为深入开展BLV的基础和应用研究提供了有效平台，具有重要的科学应用价值。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0023]图1为本专利技术的牛白血病病毒的基因组结构的示意图；
[0024]图2为合胞体观测的结果示意图；
[0025]图3为鉴定结果鉴定步骤的效果示意图，其中图3a为间接免疫荧光检测抗原以及遗传稳定性分析的结果示意图，图3b为转染后传代的Tb 1 Lu细胞RT
‑
PCR的结果示意图；
[0026]图4为反转录酶活性测定的结果示意图；
[0027]图5为得到的基因片段与pCAGGS
‑
BLV17985的测序结果的对比示意图。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例
对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。
[0029]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。
[0030]其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：引物设计：根据目标菌株基因组序列设计引物；基因扩增和构建质粒：使用引物对于目标基因进行PCR扩增，使用同源重组方法将目的基因构建到质粒pCAGGS中；病毒拯救：培养细胞，转染，然后进行传代，熔融后每一代进行间接免疫荧光，观察增殖情况；病毒拯救鉴定：进行合胞体观测、遗传稳定性分析，抗原检测，逆转录酶活性测定；鉴定结果：观测病毒拯救鉴定结果。2.根据权利要求1中所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法，其特征在于：所述引物设计中，所述引物针对的为BLV毒株全基因组序列。3.根据权利要求1中所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法，其特征在于：所述引物设计中，得到的引物包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8。4.根据权利要求3中所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制备方法，其特征在于：所述基因扩增和构建质粒中，所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2配合扩增基因A，所述SEQ ID No.3、SEQ ID No.4配合扩增基因B，SEQ ID No.5、SEQ ID No.6配合扩增基因C，SEQ ID No.7、SEQ ID No.8配合扩增基因D。5.根据权利要求4中所述的牛白血病病毒全长感染性克隆的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨奕，宫再成，彭雅兰，孙洁，孟伊宁，郝小利，商绍彬，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：