Bli-sir2用于线粒体功能障碍及线粒体脑肌病防治药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种pEGFP

【技术实现步骤摘要】
Bli
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sir2用于线粒体功能障碍及线粒体脑肌病防治药物中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，更具体地说，涉及一种能恢复细胞线粒体功能并改善线粒体神经胃肠型脑肌病小鼠病症的地衣芽孢杆菌sir2蛋白的重组质粒的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]线粒体脑肌病是一类由线粒体DNA（mtDNA）或核DNA（nDNA）突变引起的线粒体结构或功能损伤、三磷酸腺苷( ATP) 合成异常，导致中枢神经系统和肌肉组织等多系统功能障碍的疾病。线粒体神经胃肠型脑肌病（MNGIE）是一种特殊类型的线粒体脑肌病，临床上常以胃肠功能紊乱，伴有眼肌麻痹、听力丧失、周围神经病及白质脑病为特点。
[0003]胸腺嘧啶核苷磷酸化酶（TP）基因（TYMP）突变是MNGIE 发病的主要原因，该基因位于常染色体22q13.32，具有10个外显子， 1号外显子为调节区，2~10外显子为编码区，编码482个氨基酸。目前已发现 79 个不同的突变，包括错义突变、拼接位点突变、缺失突变、单核苷酸插入突变、重复突变和移码突变等，其中错义突变最为常见。TP在细胞内起着讲解脱氧胸苷（dThd）和脱氧尿苷（dUrd）的作用，并具有间接促进血管生成、抑制胶质细胞增殖以及细胞营养等功能。TP催化活性降低或丧失，则使得外周血和组织中的dThd和 dUrd大量积累，影响了三磷酸脱氧核苷酸库（dNTPs）的平衡。因此，当TYMP基因突变时，TP表达异常，循环中dThd和dUrd浓度突增，线粒体摄取过量dThd和dUrd而产生过量的脱氧胸苷三磷酸（dTTP）和脱氧尿苷三磷酸（dUTP），导致mtDNA的复制异常，出现耗竭、多发缺失和点突变，进而引发MNGIE。
[0004]作为益生菌的一类，芽孢杆菌（Bacillus）通过发挥生物拮抗作用及产生抗菌物质来抑制其他病原菌的生长，还可以刺激淋巴组织进入免疫准备状态，提高宿主的防御功能，起到增强机体抵抗力、提高饲料转化率的作用。其中，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL3是近年来益生菌菌株研发的热点。Bl3是一种革兰氏阳性（G+）、兼性厌氧、孢子形成的益生菌，易于在机体肠道内萌发生长，对大肠杆菌、致病性弧菌具有很强的抑制作用，而对双歧杆菌、乳酸菌有促进和共生作用。Bl3因其能表达各种蛋白和酶已被广泛应用于畜牧业、农业、医药、食品等方面。
[0005]Sir2（Silence information regulator，沉默信息调节因子）蛋白主要位于细胞的核仁，是一类高度保守的烟酰腺嘌呤二核苷酸依赖性去乙酰化酶，在细菌和哺乳动物中都存在。Sir2蛋白由于其独特性质，在细胞氧化应激、代谢紊乱调节方面已有较普遍的研究，其能逆转细胞线粒体功能障碍特点也是研究的热点。目前，由线粒体DNA突变诱发的以线粒体功能异常为主要特征的线粒体神经胃肠型脑肌病尚无明显有效治疗手段，将具有改善线粒体特点的益生菌sir2蛋白应用于这项病症的研究具有重要研究意义。根据NCBI查询结果，地衣芽孢杆菌sir2蛋白全长为578个氨基酸，其中第115
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264个氨基酸区域为sir2样区域，第411
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508个氨基酸区域为其甲基转移酶结构域，第411
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417,439
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440,464
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466,483
个氨基酸是腺苷甲硫氨酸结合位点，结合方式为化学结合。。

技术实现思路

[0006]（一）专利技术目的本专利技术的目的在于构建一个有效表达地衣芽孢杆菌Bli
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sir2蛋白的表达质粒pEGFP
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N1
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Bli
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sir2，并将其应用到线粒体功能障碍的HaCaT细胞模型，更进一步的将其用于MNGIE模型小鼠的治疗研究，阐明Bli
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sir2恢复损伤线粒体的效果。采用这种基因重组的方法，能使目的基因在细胞及动物体内高效表达，促进Bli
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sir2蛋白在细胞线粒体疾病及线粒体脑肌病的防治药物中的应用。
[0007]（二）技术方案为解决上述问题，本专利技术提出了pEGFP
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N1
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Bli
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sir2质粒的构建原理和方法，将该质粒转染到细胞后能高效表达地衣芽孢杆菌sir2蛋白，将该质粒通过尾静脉注射到MNGIE小鼠模型，检测小鼠脑组织和肝组织中线粒体功能的指标，以证明Bli
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sir2蛋白对线粒体脑组织肌病的治疗作用，，包括以下步骤：S1、在本专利技术中，我们在含有Kanr遗传标记的荧光表达载体pEGFP
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N1上引入Bli
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sir2基因组DNA，成功设计了能高效表达地衣芽孢杆菌sir2蛋白的pEGFP
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N1
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Bli
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sir2；S2、本专利技术将Bli
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sir2蛋白表达质粒转染至H2O2诱导的线粒体功能障碍的HaCaT细胞模型，Western blot验证了Bli
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sir2蛋白能够在细胞内正常表达，采用MTT法方法检测了质粒转染前后细胞的存活情况，使用DCFH
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DA探针检测了质粒转染前后细胞活性氧ROS的水平，用试剂盒测量了ATP生成量，通过Western blot检测了线粒体动力学蛋白以及自噬相关蛋白的表达情况，抗氧化酶测定试剂盒评估了细胞内抗氧化酶和ATP合酶的表达水平。
[0008]S3、本专利技术将包裹有Bil
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sir2表达质粒的靶向阳离子脂质体通过尾静脉注射到MNGIE模型小鼠体内，检测了使用Bli
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sir2蛋白治疗前后的MNGIE小鼠脑组织和肝组织的ROS、ATP的水平，并使用试剂盒等方法检测了脑组织和肝组织线粒体DNA含量以及呼吸链相关酶细胞色素c氧化酶的情况，Western blot检测了线粒体转录因子蛋白、动力学蛋白及自噬蛋白表达情况。
附图说明
[0009]图1为本专利技术实施例1中pEGFP
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N1
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Bli
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sir2质粒构建图谱。
[0010]图2为实施例1 中pEGFP
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N1
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Bli
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sir2双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图。其中M：marker，1：pEGFP
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N1
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Bli
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sir2。
[0011]图3为实施例2中H2O2浓度与细胞存活率关系，*p＜0.05，**p＜0.01 vs. Normal组。
[0012]图4为实施例2免疫印迹法检测重组质粒Bli
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Sir2蛋白的表达情况，其中1为未转染组；2为pEGFP
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N1空质粒转染组；3为pEGFP
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N1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达地衣芽孢杆菌Bli
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sir2基因的重组质粒的构建原理和作用机制，该质粒命名为pEGFP
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N1
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Bli
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sir2。2.权利要求1所述的pEGFP
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N1
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Bli
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sir2重组质粒，是将地衣芽孢杆菌sir2蛋白基因组引入具有卡那霉素抗性（Kanr）遗传标记的荧光表达载体pEGFP
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N1，其特征在于Bli
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sir2基因的重组和Bli
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sir2蛋白在细胞以及动物体内的高效表达。3.权利要求1所述的pEGFP
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N1
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Bli
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sir2重组质粒能逆转过氧化氢诱导的HaCaT细胞的线粒体功能障碍，使线粒体功能异...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓健善，孙含蓄，利时雨，冯丽霞，孙晗笑，
申请(专利权)人：广州弘润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：