一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开的是本发明专利技术提供了一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用，首先在分子水平以pCB质粒为载体，通过酶切连接的方法将IL

【技术实现步骤摘要】
一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用，更具体一点说，涉及一种表达IL
‑
7和CCL19的重组溶瘤痘苗病毒的构建法及其应用，属于生物技术和基因治疗领域。

技术介绍

[0002]肝癌是危害人类健康的一大“杀手”。最新发布的《2020全球癌症报告》显示，肝癌的发病率在所有癌症中位居第八位，死亡率更是达到了第四位。现有的癌症治疗方法在治疗肝癌后，容易发生复发和转移，所以急需寻找新的治疗肝癌的方法。溶瘤病毒疗法可以靶向性的选择肿瘤细胞且不会引发癌症患者严重不良反应，在众多溶瘤病毒载体中，溶瘤痘苗病毒具有独特的优势。
[0003]溶瘤病毒疗法作为一种新型癌症治疗策略，在肿瘤治疗方面取得一些令人鼓舞的成果，目前已有一些溶瘤病毒正在进行I期和II期临床试验。近年来，溶瘤腺病毒已成为溶瘤病毒疗法中一种有效的抗肿瘤药物，因其在恶性肿瘤中具有选择性复制能力，能靶向裂解肿瘤细胞，而对正常细胞不会引起明显的杀伤作用。痘苗病毒是一种双链的DNA病毒，它能够在细胞中快速复制并裂解细胞，但是在病毒进入细胞到产生子代病毒的整个感染过程中，痘苗病毒始终只存在于细胞质中[1],所以病毒DNA不会整合到宿主细胞基因组中,也就不会诱发肿瘤。痘苗病毒还具有较大的基因组，可以允许插入至少25kb的外源基因，这一特点为构建携带不同功能基因的痘苗病毒提供了便利。
[0004]2001年，刘新垣院士首次提出了癌症靶向基因病毒治疗(Cancer targeted gene
‑
virus therapy,CTGVT)策略，在溶瘤腺病毒的DNA上插入抑癌基因，利用溶瘤腺病毒的复制性实现了抑癌基因在癌症治疗中的稳定表达。针对癌症的靶向双基因病毒治疗再次成为有前景的抗肿瘤治疗策略。因此，将双重治疗基因的选择性重组对于实现癌症靶向基因病毒治疗至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供具有能够解决现有的用于治疗肝癌的药物疗效欠佳问题等技术特点的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]本专利技术一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，包括如下步骤：
[0008]1)构建TK(胸苷激酶)区缺失的pCB质粒；
[0009]2)以pCB质粒为载体，通过酶切连接的方法将目的基因连接到载体质粒上以构建pCB
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IL
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7质粒、pCB
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CCL19质粒和pCB
‑
IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19质粒；目的基因包括IL
‑
7基因、CCL19基因和IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19基因；
[0010]3)通过脂质体转染，将步骤2)所得的pCB
‑
IL
‑
7质粒、pCB
‑
CCL19质粒和pCB
‑
IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19质粒分别转至293A细胞，获得3种重组溶瘤痘苗病毒。
[0011]优选的，1)首先应用高保真PCR方法扩增IL
‑
7基因片段、CCL19基因片段和IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19基因片段；
[0012]2)然后将3种基因片段通过限制酶酶切和连接酶连接的方法连接到pCB载体质粒中，得到pCB
‑
hIL
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7质粒、pCB
‑
hCCL19质粒和pCB
‑
IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19质粒；
[0013]3)将3种重组质粒和野生病毒通过脂质体转染的方法在293A细胞内同源重组包装病毒；
[0014]4)步骤3)所属野生病毒为经过改造TK缺失的WR株；
[0015]5)包装后经过药物筛选(黄嘌呤、次黄嘌呤和霉酚酸进行至少3次药筛，霉酚酸可以阻断野生病毒鸟嘌呤的合成抑制野生病毒的复制，重组病毒在gpt基因、黄嘌呤和次黄嘌呤存在的条件下可以替代鸟嘌呤合成途径)；
[0016]6)挑空斑筛选，药筛后的病毒梯度稀释后铺低熔点胶，出现病毒空板后挑取空板提基因组，PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因，鉴定正确后扩增病毒，获得3种重组溶瘤痘苗病毒，分别未溶瘤痘苗病毒vv
‑
IL
‑
7、vv
‑
CCL19、vv
‑
IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19。
[0017]优选的，利用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切IL
‑
7和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB
‑
IL
‑
7重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB
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CCL19重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB
‑
IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19重组质粒。
[0018]优选的，IL
‑
7的引物如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；CCL19引物如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19引物如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示，IL
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7基因序列如SEQ ID NO.5所示；CCL19基因序列如SEQ ID NO.6所示；IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19基因序列如SEQ ID NO.7所示。
[0019]优选的，药物筛选为：
[0020]用含有1
×
黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基筛选重组病毒，将构建得到的溶瘤痘苗病毒vv
‑
IL
‑
7、vv
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CCL19、vv
‑
IL
‑7‑
F2A
‑
CCL19感染293A细胞2小时后，用含有1
×
黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸3种药物的培养基培养，带细胞基本病变，收集细胞，
‑
80℃和37℃反复冻融3次，1000rpm离心5mins，此过程重复至少3次。
[0021]优选的，鉴定为：对3种重组溶瘤痘苗病毒进行qPCR、westernblot和Elisa检测，检测痘苗病毒感染肿瘤细胞是否表达IL
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1)构建TK区缺失的pCB质粒；2)以pCB质粒为载体，通过酶切连接的方法将目的基因连接到载体质粒上以构建pCB
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IL
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7质粒、pCB
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CCL19质粒和pCB
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IL
‑7‑
F2A
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CCL19质粒；目的基因包括IL
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7基因、CCL19基因和IL
‑7‑
F2A
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CCL19基因；3)通过脂质体转染，将步骤2)所得的pCB
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IL
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7质粒、pCB
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CCL19质粒和pCB
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IL
‑7‑
F2A
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CCL19质粒分别转至293A细胞，获得3种重组溶瘤痘苗病毒。2.根据权利要求1所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：1)首先应用高保真PCR方法扩增IL
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7基因片段、CCL19基因片段和IL
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F2A
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CCL19基因片段；2)然后将3种基因片段通过限制酶酶切和连接酶连接的方法连接到pCB载体质粒中，得到pCB
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hIL
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7质粒、pCB
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hCCL19质粒和pCB
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IL
‑7‑
F2A
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CCL19质粒；3)将3种重组质粒和野生病毒通过脂质体转染的方法在293A细胞内同源重组包装病毒；4)步骤3)所属野生病毒为经过改造TK缺失的WR株；5)包装后经过药物筛选；6)挑空斑筛选，药筛后的病毒梯度稀释后铺低熔点胶，出现病毒空板后挑取空板提基因组，PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因，鉴定正确后扩增病毒，获得3种重组溶瘤痘苗病毒，分别未溶瘤痘苗病毒vv
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IL
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7、vv
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CCL19、vv
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IL
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F2A
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CCL19。3.根据权利要求2所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：利用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切IL
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7和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB
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IL
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7重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB
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CCL19重组质粒；利用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切IL
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F2A
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CCL19和pCB质粒，并将酶切后的大小产物利用连接酶连接，得到pCB
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IL
‑7‑
F2A
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CCL19重组质粒。4.根据权利要求1或2或3所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法，其特征在于：IL
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7的引物如...

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅刚，张蕾蕾，龙宇歌，曹玉婷，李强，周秀梅，黄飚，
申请(专利权)人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：