表达三种人源基因的SARS-CoV-2易感模型猪的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了表达三种人源基因的SARS

【技术实现步骤摘要】
表达三种人源基因的SARS
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CoV
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2易感模型猪的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及基因编辑技术，具体涉及采用CRISPR/Cas9系统及同源重组技术构建的在基因组的特定位置整合并表达三个人源基因(ACE2基因、AXL基因和TMPRSS2基因)的猪重组细胞，利用该重组细胞可以制备SARS
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CoV
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2易感模型猪，从而将其用于生物医药领域。

技术介绍

[0002]人类血管紧张素I转化酶2(hACE2)为人类血管紧张素转换酶同源物，是一种锌金属蛋白酶，属于1型跨膜蛋白，其作为SARS
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CoV
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2和SARS
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CoV等冠状病毒在人体内的受体蛋白，广泛存在于人体各个组织中，是目前已知导致SARS
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CoV
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2进入宿主细胞并造成宿主发病的关键蛋白。
[0003]SARS
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CoV
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2进入宿主细胞需要依赖于病毒的刺突蛋白(S)与细胞受体的结合，并通过宿主细胞蛋白酶激活S蛋白，而人丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)在此过程中行使着激活S蛋白的关键功能。
[0004]此外，人AXL受体酪氨酸激酶已被发现是一种不依赖于ACE2的SARS
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CoV
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2新受体，其通过特异性结合SARS
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CoV
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2刺突蛋白N端的NTD区域，介导病毒在呼吸系统细胞上的吸附与内化。
[0005]目前，尚未有针对SARS
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CoV
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2的特效药物，世界各国都在争分夺秒地开展SARS
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CoV
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2疫苗的研发。而动物模型对于阐明SARS
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CoV
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2的感染与发病机制、传播途径以及抗病毒药物和疫苗及抗体的开发和评价至关重要。
[0006]现有技术中，常用的模式动物为小鼠。小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。而猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
[0007]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

技术实现思路

[0008]本专利技术解决的技术问题为提供了采用CRISPR/Cas9系统及同源重组技术构建的在基因组的特定位置整合并表达三个人源基因(ACE2基因、AXL基因和TMPRSS2基因)的猪重组细胞，进一步，利用该重组细胞通过体细胞核移植技术得到了SARS
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CoV
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2易感模型猪，该模型猪可用于下一步的药物、疫苗及抗体筛选和药物、疫苗及抗体效果评价以及发病机制的研究等。
[0009]本专利技术提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将命名为DNA分子甲的
DNA分子整合至猪细胞的基因组DNA，得到重组细胞；所述DNA分子甲表达人源ACE2蛋白、人源AXL蛋白和人源TMPRSS2蛋白。
[0010]具体的，人源ACE2蛋白(hACE2蛋白)如SEQ ID NO：15所示。
[0011]具体的，人源AXL蛋白(hAXL蛋白)，如SEQ ID NO：16所示。
[0012]具体的，人源TMPRSS2蛋白(hTMPRSS2蛋白)，如SEQ ID NO：17所示。
[0013]人源ACE2蛋白由人ACE2基因编码。
[0014]人源AXL蛋白由人AXL基因编码。
[0015]人源TMPRSS2蛋白由人TMPRSS2基因编码。
[0016]具体的，人ACE2基因(hACE2基因)如SEQ ID NO：14中第2290
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4704位核苷酸所示。
[0017]具体的，人AXL基因(hAXL基因)如SEQ ID NO：14中第4771
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6648位核苷酸所示。
[0018]具体的，人TMPRSS2基因(hTMPRSS2基因)如SEQ ID NO：14中第6712
‑
8298位核苷酸所示。
[0019]所述DNA分子甲中，人ACE2基因、人AXL基因和人TMPRSS2基因存在于同一表达盒。
[0020]所述DNA分子甲中，人ACE2基因、人AXL基因和人TMPRSS2基因由同一启动子启动表达。
[0021]具体的，所述启动子为人hEF1α启动子。
[0022]具体的，人hEF1α启动子如SEQ ID NO：14中第1094
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2271位核苷酸所示。
[0023]所述DNA分子甲中，人ACE2基因、人AXL基因和人TMPRSS2基因由同一终止密码子终止表达。
[0024]所述DNA分子甲中，人ACE2基因、人AXL基因和人TMPRSS2基因共用一个Poly(A)信号。
[0025]具体的，所述Poly(A)信号为EF1αPoly(A)。
[0026]具体的，EF1αPoly(A)如SEQ ID NO：14中第8302
‑
8874位核苷酸所示。
[0027]所述DNA分子甲中，人ACE2基因、人AXL基因和人TMPRSS2基因存在于同一编码框，基因之间由2A肽的编码基因间隔。2A肽又称为自剪接肽或自裂解肽或2A自剪切肽或2A自裂解肽。
[0028]所述2A肽具体可为P2A肽。
[0029]所述2A肽具体可为T2A肽。
[0030]具体的，所述P2A肽的编码基因如SEQ ID NO：14中第4705
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4770位核苷酸所示。
[0031]具体的，所述T2A肽的编码基因如SEQ ID NO：14中第6649
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6711位核苷酸所示。
[0032]具体的，所述DNA分子甲中，人ACE2基因、人AXL基因和人TMPRSS2基因所在的编码框如SEQ ID NO：14中第1094
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8874位核苷酸所示。
[0033]所述DNA分子甲中还包括抗性筛选基因表达盒。所述抗性筛选基因可为编码Puromycin抗性蛋白的基因。所述抗性筛选基因表达盒如SEQ ID NO：14中第8987
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10262位核苷酸所示。
[0034]所述DNA分子甲中还包括LoxP序列。
[0035]所述DNA分子甲中具体包括2个LoxP序列，分别如SEQ ID NO：14中第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将命名为DNA分子甲的DNA分子整合至猪细胞的基因组DNA，得到重组细胞；所述DNA分子甲表达人源ACE2蛋白、人源AXL蛋白和人源TMPRSS2蛋白。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA分子甲中，人ACE2基因、人AXL基因和人TMPRSS2基因存在于同一编码框，它们之间由2A肽的编码基因间隔。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述DNA分子甲整合至猪细胞的基因组DNA的COL1A1基因位点中。4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述“将命名为DNA分子甲的DNA分子整合至猪细胞的基因组DNA”的实现方式为：将命名为DNA分子乙的DNA分子导入猪细胞或者将具有所述DNA分子乙的重组质粒导入猪细胞；所述DNA分子乙中，具有所述DNA分子甲且在所述DNA分子甲的上游具有上游同源臂且在所述DNA分子甲的下游具有下游同源臂，所述上游同源臂和所述下游同源臂用于将所述DNA分子甲整合至猪细胞的基因组DNA。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中，具有所述DNA分子乙的重组质粒与两个辅助质粒共同导入猪细胞；所述两个辅助质粒为sgRNA质粒和Cas9质粒；sgRNA质粒转录得到特异sgRNA；所述特异sgRNA为sgRNA
COL1A1
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g3
；sgRNA
COL1A1
‑
g3
的靶序列结合区如SEQ ID NO：13中第1
‑
20位核苷酸所示；Cas9质粒表达Cas9蛋白。6.一种试剂盒，包括权利要求4中所述的DNA分子乙；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备SARS
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CoV
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2易感模型猪；(c)制备SARS
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CoV
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2易感猪细胞模型或SARS
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CoV
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2易感猪组织模型或SARS
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CoV
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2易感猪器官模型。7.一种试剂盒，包括具有权利要求4中所述的DNA分子乙的重组质粒；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备SARS
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CoV
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2易感模型猪；(c)制备SARS
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CoV
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2易感猪细胞模型或SARS
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CoV
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2易感猪组织模型或SARS
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CoV
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2易感猪器官模型。8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括sgRNA质粒和Cas9质粒；sgRNA质粒为权利要求5中所述的sgRNA质粒；Cas9质粒为权利要求5中所述的Cas9质粒。9.权利要求4中所述的DNA分子乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备SARS
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CoV
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2易感模型猪；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，马翔，刘瑜，曾为俊，王磊，程锐，赵泽英，黄彩云，刘璐，陶裴裴，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：