一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法及其应用，包括下列步骤：1)PB

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]神经胶质瘤(Glioma)是中枢神经系统常见肿瘤。胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)更是恶性程度极高的神经系统肿瘤。胶质母细胞瘤GBM根据其基因表达等特征，又可以分为神经前体型(proneural,PN)、间充质型(mesenchymal,MES)(MES),经典型(classical，CL)和神经型(neural,NL)。不同的肿瘤亚型往往与不同的基因突变相关。比如，超过90％否认CL
‑
GBM具有增强的EGFR活性和CDKN2A缺失，MES
‑
GBM常与NF1/PTEN基因突变有关，而绝大部分PN
‑
GBM中可以观察到PDGFRA扩增和IDH1基因突变。目前对胶质瘤的研究模型主要有体外培养的胶质瘤细胞，比如A172,U
‑
251等；或者通过向小鼠脑中接种体外培养的肿瘤细胞，进而形成的移植瘤。但是，这些模型都只能研究肿瘤形成后的进展、治疗效果等问题，无法研究肿瘤发生的问题，且这些细胞系状态下的肿瘤细胞与体内原发性胶质瘤往往存在很大的差别。因此，原发胶质瘤模型是胶质瘤研究以及药物筛选的必不可少的工具。
[0003]目前原发胶质瘤模型的制备主要依赖几种遗传修饰小鼠的使用，制备难度较大。常见的方法有如下几种：(1)通过NG2
‑
CreER、hGFAP
‑
CreER、Nestin
‑
Cre等表达Cre重组酶的工具鼠，结合Pten
fx/fx
或者p53
fx/fx
，LSL
‑
EGFRviii等小鼠品系，在少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)、神经前体细胞中条件性敲除p53、Nf1和Pten等基因或者激活EGFR、PDGFRa信号通路的活性；(2)借助表达禽类病毒受体A(avian tumor virus receptor A,TVA)的Olig2
‑
tva,hGFAP
‑
tva,Nestin
‑
tva工具鼠，通过向小鼠脑中注射携带外源基因的禽类病毒RCAS质粒，实现禽类病毒在小鼠神经细胞中的复制和感染，介导外源基因的持续表达，最终诱发神经胶质瘤；(3)借助表达Cas9的转基因小鼠，通过电转表达针对p53、Nf1和Pten基因的small guide RNAs的质粒，实现这些抑癌基因的失活，从而诱发小鼠原发性胶质瘤；(4)转座子系统也是近年来被采用的方法，可以通过将外源基因转座整合到特定的遗传修饰小鼠脑部神经细胞中，起到激活或者敲除特定基因的目的，从而诱发胶质瘤。但是，以上这些原发胶质瘤模型都借助了遗传修饰小鼠，因而在实施上收到原材料的限制。因此，需要开发一种可在普通野生型小鼠中实现的原发胶质瘤模型。
[0004]piggyBac转座子系统也被证明可以有效实现外源基因在小鼠细胞中的稳定表达，并且比其他转座子系统具有更高的效率，是在小鼠组织中表达外源基因或者进行基因敲除的理想方法。已有研究表明，单独激活Pdgfa基因的持续表达，即可在小鼠脑中诱发前述PN
‑
GBM样神经胶质瘤。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法及其应用，以解决现有技术的上述问题。
[0006]本专利技术的方案是：
[0007]一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法，包括下列步骤：
[0008]1)PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP质粒构建，所述PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP质粒包含启动子与下游的IRES
‑
EGFP序列，在启动子与IRES
‑
EGFP序列之间加入多克隆位点；
[0009]2)PB
‑
CAG
‑
Pdgfa
‑
HA
‑
IRES
‑
EGFP质粒的构建，将Pdgfa基因插入到所述PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP质粒的多克隆位点，表达携带HA标签的PDGFA蛋白与用于示踪的绿色荧光蛋白EGFP；
[0010]3)原发胶质瘤小鼠模型的制备，通过将质粒PB
‑
CAG
‑
Pdgfa
‑
HA
‑
IRES
‑
EGFP与表达转座酶的质粒pCAGGS
‑
piggyBac Transposase共同使用，诱导小鼠，获得原发胶质瘤小鼠模型。
[0011]作为优选的技术方案，所述启动子为CAG启动子或其他哺乳动物细胞可用的启动子。
[0012]作为优选的技术方案，所述PB
‑
CAG
‑
Pdgfa
‑
HA
‑
IRES
‑
EGFP质粒在piggyBac转座酶存在时被整合入细胞基因组中，实现目标基因在转入细胞及其子代细胞中的稳定表达。
[0013]本专利技术还公开了一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法用piggyBac转座子质粒PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP，所述PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0014]本专利技术还公开了一种小鼠原发神经胶质瘤模型制备方法的应用，为神经胶质瘤的发生与治疗研究提供重要的研究模型。
[0015]由于采用了上述技术方案一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法，包括下列步骤：1)PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP质粒构建，所述PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP质粒包含启动子与下游的IRES
‑
EGFP序列，在启动子与IRES
‑
EGFP序列之间加入多克隆位点；2)PB
‑
CAG
‑
Pdgfa
‑
HA
‑
IRES
‑
EGFP质粒的构建，将Pdgfa基因插入到所述PB
‑
C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：1)PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP质粒构建，所述PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP质粒包含启动子与下游的IRES
‑
EGFP序列，在启动子与IRES
‑
EGFP序列之间加入多克隆位点；2)PB
‑
CAG
‑
Pdgfa
‑
HA
‑
IRES
‑
EGFP质粒的构建，将Pdgfa基因插入到所述PB
‑
CAG
‑
MCS
‑
IRES
‑
EGFP质粒的多克隆位点，表达携带HA标签的PDGFA蛋白与用于示踪的绿色荧光蛋白EGFP；3)原发胶质瘤小鼠模型的制备，通过将质粒PB
‑
CAG
‑
Pdgfa
‑
HA
‑
IRES
‑
EG...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄浩，何婉君，邱猛生，
申请(专利权)人：浙江欧赛思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：