一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法，依次包括以下步骤：a)FBL全长ORF基因克隆；b)将FBL全长ORF基因连接pEGFP

【技术实现步骤摘要】
一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法及应用，属于分子细胞生物学和生物化学


技术介绍

[0002]癌症一直是生命健康领域的重大难题，严重威胁人类健康。对于晚期癌症患者来说，由于肿瘤侵袭远端器官多数已经无法进行手术治疗，只能依靠化疗来维持生存。迄今为止，已有超过250种抗癌药物被用于临床癌症化疗。然而，最常用的一线抗癌化疗药物是抑制基因组DNA代谢或细胞有丝分裂，但无法特异性地清除肿瘤细胞。因此，长期使用这些化疗药物会杀伤正常细胞，引起严重的副作用，同时还会造成肿瘤细胞耐药，导致晚期癌症患者的死亡。开发筛选新型、靶向肿瘤的抗癌药物的方法具有重要的研发价值。
[0003]RNA聚合酶I是一类极具潜力的肿瘤治疗靶点。一方面，肿瘤细胞由于细胞周期紊乱，可以进行无节制扩增，而肿瘤细胞的大量增殖必须依靠丰富的核糖体，以合成增殖所必需的蛋白质。而核糖体的合成及组装依赖于RNA聚合酶I转录的rRNA，并且几乎在所有肿瘤中，RNA聚合酶I的表达水平远高于在正常组织中的表达水平。所以抑制RNA聚合酶I的功能，降低rRNA转录水平，能阻断细胞核糖体组装，从而无法提供肿瘤细胞大量增殖所必须的蛋白质，发挥肿瘤抑制的作用。另一方面，由于很多种癌症细胞都存在DNA损伤修复的缺陷，这些癌症细胞对特定的修复通路的阻断异常敏感。阻断这些通路会造成DNA损伤修复缺陷的癌症细胞死亡。已有研究证实，在DNA双链断裂的修复过程中，前体rRNA参与MDC1、γH2AX、BRCA1等损伤修复因子的招募，抑制rRNA的转录能阻断DNA双链断裂过程中foci的形成，使得修复因子不能加载至损伤位点，从而阻断修复的进行，最终导致细胞基因组不稳定及细胞凋亡。筛选RNA聚合酶I的小分子抑制剂，抑制rDNA的转录，从而阻断肿瘤细胞双链断裂修复，最终能诱导肿瘤细胞死亡。因此，利用小分子化疗药，抑制RNA聚合酶I的转录活性，一方面能快速抑制核糖体生物合成，另一方面阻断细胞的双链断裂修复通路，在肿瘤治疗方面是极具潜质的新型靶标。因此，开发灵敏、高通量的RNA聚合酶I抑制剂的筛选方法具有重要的研究价值。
[0004]rRNA是在RNA聚合酶I的作用下以rDNA为模板转录而成，整个过程发生在核仁中。核仁位于细胞核中，通常是单一或者多个匀质的球形小体，呈圆形或椭圆形的颗粒状结构，无包膜。核仁具有三层结构，由内向外包括纤维中心、致密纤维组分和颗粒组分三部分。纤维中心被致密纤维组分包围，主要成份为rDNA。致密纤维组分由致密的纤维构成，是新合成的rRNA及其结合蛋白的场所。颗粒组分由核糖核蛋白颗粒构成，是正在加工成熟的核糖体亚单位的前体颗粒。rRNA的加工成熟依赖于rRNA甲基转移酶FBL的作用，正常情况下，FBL均匀分布在核仁中。当RNA聚合酶I功能异常时，rDNA转录受抑制，核仁发生应激，使得FBL在核仁中形成1
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3个数目不等的聚体，并转移至核仁边缘。本专利技术利用核仁应激时，FBL在核仁中定位的改变，筛选出能稳定表达带EGFP荧光信号的FBL蛋白的HeLa细胞。当用小分子抑制剂处理细胞时，在荧光显微镜下观察EGFP荧光信号的定位，以此判断该小分子是否能特异性
抑制RNA聚合酶I的活性，同时用实时荧光定量PCR方法验证rRNA转录水平是否被抑制。
[0005]传统的RNA聚合酶I小分子抑制剂筛选方法是在体外利用重组的RNA聚合酶I，将经P32标记的核糖核苷酸生成rDNA后进行琼脂糖凝胶电泳，通过检测P32放射性强度来评估RNA聚合酶I的活性。此方法实际操作过程中具有以下几大难处：1.获得纯度和活性好的RNA聚合酶I蛋白困难；2.P32具放射性，在一般实验条件下无法操作，对实验室级别和操作人员要求高；3.无法满足高通量筛选，操作复杂，试验周期较长。
[0006]【专利技术专利内容】
[0007]本专利技术专利的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法，无需制备RNA聚合酶I蛋白，无需使用P32放射性材料，操作要求低，对实验室条件要求低，筛选成本低。
[0008]为实现上述目的，本专利技术专利提出了一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法，依次包括以下步骤：a)FBL全长ORF基因克隆；b)将FBL全长ORF基因连接pEGFP
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C1载体得到重组质粒；c)重组质粒测序验证获取正确质粒；d)正确质粒转染HeLa细胞；e)筛选出能稳定表达EGFP
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FBL蛋白的HeLa细胞；f)判断EGFP
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FBL是否聚集，否则转入g步骤，是则转入h步骤；g)提示该小分子不造成核仁应激，不予考虑，然后结束；h)验证45S pre
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rRNA水平是否降低，且不影响GAPDH mRNA转录，是则转入i步骤，否则结束；i)筛选出有效抑制RNA聚合酶I的小分子化合物，提示为Pol Ii，然后结束。
[0009]作为优选，所述d)步骤中采用脂质体转染试剂将正确质粒转染HeLa细胞。
[0010]作为优选，所述d)步骤中脂质体转染试剂采用Lipofectamine 2000。
[0011]作为优选，所述e)步骤中在转染24小时后，用0.5mg/ml的G418进行筛选，得到能稳定表达EGFP
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FBL蛋白的HeLa细胞。
[0012]作为优选，所述f)步骤中将能稳定表达EGFP
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FBL蛋白的HeLa细胞制备成104个/ml的细胞悬液，以100μL/孔悬液加入平底、透明的96孔细胞培养板中，培养板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养过夜，直至细胞完全贴壁生长，用DMSO配制160个小分子化合物溶液，每孔细胞中加入一种小分子化合物，化合物终浓度为20μM，DMSO浓度不超过0.1％，处理细胞2小时，然后置于荧光显微镜下观察EGFP
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FBL荧光信号的分布，以0.1％DMSO处理作为阴性对照，EGFP
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FBL荧光信号呈弥散状，均匀分布在HeLa细胞核仁中；以1μM BMH21处理作为阳性对照，EGFP
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FBL荧光信号聚集成1个或多个高亮点状信号，分布于核仁边缘。
[0013]作为优选，所述h)步骤中采用实时荧光定量PCR分析，验证细胞45Spre
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rRNA的水平是否显著降低，而GAPDH基因的mRNA转录水平不影响。
[0014]为实现上述目的，本专利技术专利还提出了一种RNA聚合酶I小分子抑制剂的用途，将前述得到的RNA聚合酶I小分子抑制剂用于抗癌化疗药物。
[0015]本专利技术专利的有益效果：本专利技术与传统筛选方法相比，利用稳定表达EGFP
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FBL蛋白的HeLa细胞筛选RNA聚合酶I小分子抑制剂，筛选出特异性抑制RNA聚合酶I活性的小分子，并且对RNA聚合酶II活性无影响。具有操作简本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：依次包括以下步骤：a)FBL全长ORF基因克隆；b)将FBL全长ORF基因连接pEGFP
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C1载体得到重组质粒；c)重组质粒测序验证获取正确质粒；d)正确质粒转染HeLa细胞；e)筛选出能稳定表达EGFP
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FBL蛋白的HeLa细胞；f)判断EGFP
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FBL是否聚集，否则转入g步骤，是则转入h步骤；g)提示该小分子不造成核仁应激，不予考虑，然后结束；h)验证45S pre
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rRNA水平是否降低，且不影响GAPDH mRNA转录，是则转入i步骤，否则结束；i)筛选出有效抑制RNA聚合酶I的小分子化合物，提示为Pol Ii，然后结束。2.如权利要求1所述的一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：所述d)步骤中采用脂质体转染试剂将正确质粒转染HeLa细胞。3.如权利要求2所述的一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：所述d)步骤中脂质体转染试剂采用Lipofectamine 2000。4.如权利要求1所述的一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：所述e)步骤中在转染24小时后，用0.5mg/ml的G418进行筛选，得到能稳定表达EGFP
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FBL蛋白的HeLa细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴朵，施松，贺虎，刘颂，
申请(专利权)人：杭州圣域生物医药科技有限公司，
类型：发明
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