一种高通量筛选ADP核糖水解酶抑制剂的方法技术

本申请涉及一种高通量筛选ADP核糖水解酶抑制剂的方法，属于生物化学技术领域。一种高通量筛选ADP核糖水解酶抑制剂的方法，该方法以His

【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选ADP核糖水解酶抑制剂的方法


[0001]本申请涉及生物化学
，且特别涉及一种高通量筛选ADP核糖水解酶抑制剂的方法。

技术介绍

[0002]ADP核糖基化修饰（ADPr）是一种重要的翻译后修饰，在细胞内的DNA损伤修复过程中起着关键作用。它是由ADP核糖聚合酶催化，利用NAD+为底物，在特定的蛋白上形成ADP核糖基化修饰。ADP核糖基化修饰可以调控DNA损伤修复途径的激活和细胞的快速应答，从而维护基因组的完整性。
[0003]ADP核糖水解酶在DNA损伤修复中起着重要的调控作用，它能够水解PAR链，从而解开ADP核糖基化修饰的蛋白与DNA或其他蛋白质之间的结合，为后续的DNA修复步骤提供必要的条件。因此，ADP核糖水解酶成为了抗肿瘤药物研究的新兴靶点。要充分发挥ADP核糖水解酶在DNA损伤修复中的重要作用，需要寻找有效的抑制剂来干预其活性。传统的筛选方法往往受限于低通量、耗时长和试剂昂贵的特点。高通量筛选方法的出现极大地提高了筛选效率和效果，使研究人员能够快速评估大量化合物的抑制效果，并筛选出具有潜在药物活性的化合物。因此，开发一种高通量筛选ADP核糖水解酶抑制剂的方法对于加速新药研发、理解ADP核糖水解酶的功能机制以及促进相关疾病的治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本申请实施例的目的包括提供一种高通量筛选ADP核糖水解酶抑制剂的方法，以改善传统的筛选方法低通量、耗时长和试剂昂贵的技术问题。
[0005]本申请实施例提供了一种高通量筛选ADP核糖水解酶抑制剂的方法，该方法以His
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Tb结合的且发生核糖基化修饰的His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白作为信号供体，以GST
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d2结合的GST
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X射线交叉互补修复蛋白1作为信号受体，通过体外检测均相时间分辨荧光信号变化来筛选抑制剂。
[0006]本申请采用HTRF技术通过测量供体与受体之间的荧光共振能量转移来间接监测酶活性的变化。将供体和受体标记在受ADP核糖水解酶调控的具有相互作用的一对蛋白上，当供体与受体之间的距离适合时，能量转移发生，导致受体的荧光信号发生变化。该方法基于核糖基化修饰的His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白和GST
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X射线交叉互补修复蛋白1的相互作用，核糖基化修饰的His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白和GST
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X射线交叉互补修复蛋白1的相互作用通过His
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Tb与GST
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d2的能量共振信号来呈现。本申请中筛选的是ADP核糖水解酶抑制剂，ADP核糖水解酶可以破坏核糖基化修饰的ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白和X射线交叉互补修复蛋白1的相互作用；当抑制剂抑制ADP核糖水解酶时，核糖基化修饰的ADP核糖聚合酶和X射线交叉互补修复蛋白1具有相互作用，相应的各自结合的His
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Tb与GST
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d2能够因能量共振产生信号；当抑制剂不能抑制ADP核糖水解酶时，核糖基化修饰的ADP核糖聚合酶和X射线交叉互补修复蛋白1相互作用被破坏，相应的各自结合的His
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Tb与
GST
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d2就不能够因能量共振产生信号。因此，可以通过以His
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Tb结合的核糖基化修饰的His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白和以GST
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d2 结合的GST
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X射线交叉互补修复蛋白1作为信号受体通过体外检测均相时间分辨荧光信号变化来筛选出ADP核糖水解酶抑制剂。基于HTRF技术的高通量筛选方法具有快速、灵敏、高选择性和较低的背景干扰等优势，能够加速ADP核糖水解酶抑制剂的发现和优化过程。
[0007]在本申请的部分实施例中，核糖基化修饰的His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白的制备包括：将带有His标签的ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白进行原核表达和纯化，再将纯化后的蛋白进行核糖基化修饰；GST
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X射线交叉互补修复蛋白1的制备包括：将带有GST标签的X射线交叉互补修复蛋白1进行原核表达和纯化。
[0008]His标签和GST标签在这个过程中起到了定位和纯化的作用，有利于实现对目标蛋白的选择性捕获和纯化；将ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白进行核糖基化修饰，可以模拟其在生理条件下的状态，并使其与GST标签的X射线交叉互补修复蛋白1形成相互作用。
[0009]在本申请的部分实施例中，His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白中的His标签加在ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白的N端。
[0010]在本申请的部分实施例中，GST
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X射线交叉互补修复蛋白1中的GST标签加在X射线交叉互补修复蛋白1的N端。
[0011]将His标签加在ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白的N端，GST标签加在X射线交叉互补修复蛋白1的N端可以在检测时产生合适的信号窗口。
[0012]在本申请的部分实施例中，上述方法包括：将带有GST标签的ADP核糖水解酶进行原核表达和纯化，然后将纯化后的带有GST标签的ADP核糖水解酶和待测抑制剂一起添加至微孔板中，进行孵育Ⅰ；再加入步骤S2中进行核糖基化修饰后的带有His标签的ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白，进行孵育Ⅱ；然后加入步骤S1中纯化后的带有GST标签的X射线交叉互补修复蛋白1，进行孵育Ⅲ；随后加入His
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Tb和GST
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d2，进行孵育Ⅳ；在孵育Ⅳ结束后使用酶标仪在TRF模块334nm波长激发下分别在620nm发射光和665nm发射光处进行信号采集。上述试验过程中各个试剂的添加顺序对试验非常重要，按照上述试剂添加顺序进行可以使试验结果更稳定，试验重复性高。
[0013]在本申请的部分实施例中，待测抑制剂需要使用DMSO溶解，其中，待测抑制剂在反应体系中的终浓度为0.015
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10000nM；DMSO在反应体系中的质量分数为大于0%，且小于等于0.5%。
[0014]在本申请的部分实施例中，带有GST标签的ADP核糖水解酶、带有His标签的核糖基化修饰的ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白以及带有GST标签的X射线交叉互补修复蛋白1均需要先使用缓冲液进行稀释；其中，带有GST标签的ADP核糖水解酶在反应体系中的终浓度为80pM，带有His标签的核糖基化修饰的ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白在反应体系中的终浓度为250nM，带有GST标签的X射线交叉互补修复蛋白1在反应体系中的终浓度为50nM。
[0015]DMSO可以溶解待测抑制剂，DMSO在大于0%，且小于等于0.5%的质量分数范围内蛋白质的活性不受影响。同时，通过控制待测抑制剂、带有GST标签的ADP核糖水解酶、带有His标签的核糖基化修饰的AD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选ADP核糖水解酶抑制剂的方法，其特征在于，该方法以His
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Tb结合的且发生核糖基化修饰的His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白作为信号供体，以GST
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d2结合的GST
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X射线交叉互补修复蛋白1作为信号受体，通过体外检测均相时间分辨荧光信号变化来筛选所述抑制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核糖基化修饰的His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白的制备包括：将带有His标签的ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白进行原核表达和纯化，再将纯化后的蛋白进行核糖基化修饰；所述GST
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X射线交叉互补修复蛋白1的制备包括：将带有GST标签的X射线交叉互补修复蛋白1进行原核表达和纯化。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白中的His标签加在ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白的N端。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述GST
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X射线交叉互补修复蛋白1中的GST标签加在X射线交叉互补修复蛋白1的N端。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将带有GST标签的ADP核糖水解酶进行原核表达和纯化，然后将纯化后的所述带有GST标签的ADP核糖水解酶和待测抑制剂一起添加至微孔板中，进行孵育Ⅰ；再加入所述进行核糖基化修饰后的His
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ADP核糖聚合酶功能结构域蛋白，进行孵育Ⅱ；然后加入纯化后的所述带有GST标签的X射线交叉互补修复蛋白1，进行孵育Ⅲ；随后加入His
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Tb和GST
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d2，进行孵育Ⅳ；在孵育Ⅳ结束后使用酶标仪在334nm激发下分别在620nm发射光和665nm发射光处进行信号采集。6.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔亚琦，施松，吴朵，张兰桥，许泽琼，
申请(专利权)人：杭州圣域生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：