一种基因治疗载体构建方法及在阿尔兹海默症药物的应用技术

本发明专利技术公开了一种pIRES

【技术实现步骤摘要】
一种基因治疗载体构建方法及在阿尔兹海默症药物的应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种能恢复线粒体功能并改善阿尔兹海默症小鼠症状的重组自噬载体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种与衰老相关的神经退行性疾病，AD中受影响的线粒体动力学相关蛋白包括参与线粒体融合与裂变及线粒体生物发生相关的转录因子。一项研究显示AD患者脑组织中线粒体分裂蛋白Drp1水平升高而线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1水平降低，这表明线粒体裂变的增强可能与AD中神经元功能障碍有关。对AD患者和健康者脑组织的分析显示，与线粒体生物发生有关的基因如PGC
‑
1α，TFAM和NRF2表达减少。
[0003]研究表明，PINK1能够通过募集自噬受体直接激活线粒体自噬，加速受损线粒体清除，发挥保护细胞稳态的作用，PINK1下调会导致线粒体功能障碍、氧化应激和神经功能障碍。Fang等人发现AD模型小鼠在线粒体自噬激活剂的刺激下，可通过PINK
‑
1，Parkin或DCT
‑
1依赖性途径逆转记忆障碍，减少了 Aβ蛋白的含量，防止AD模型小鼠的认知障碍，进一步的，他们还发现在tau 蛋白转基因的小鼠体内线粒体自噬的增强消除了与AD相关的tau蛋白过度磷酸化，并改善了小鼠的记忆障碍，表明线粒体自噬的受损是AD发病机制中的关键事件，并且通过线粒体自噬功能的改善代表了AD潜在的治疗干预。
[0004]分子伴侣介导的自噬(chaperone
‑
mediated autophagy，CMA)的发生首先需要热休克蛋白70(HSC70)识别底物蛋白中识别序列，并将其靶向溶酶体膜，且这识别过程需要其他共伴侣包括Hsp90，Hsp40，Hip，Hop和Bag
‑
1共同辅助，这些共伴侣参与底物蛋白的去折叠及后期底物蛋白转运到溶酶体腔内；当底物与溶酶体膜上LAMP
‑
2A蛋白的胞质尾部(溶酶体相关的膜蛋白2A型)结合后，其会触发LAMP2A的多聚化以形成介导底物易位的复合物；最后，底物进入溶酶腔内被降解。
[0005]四环素诱导的调控系统即四环素可抑制的系统(Tet
‑
Off)和四环素可诱导的系统(Tet
‑
On)。在Tet
‑
Off系统中，反式激活因子(TetR)在不存在四环素的情况下与TetO结合诱导基因表达，在存在四环素的情况下，两者分离，基因表达被抑制。而Tet
‑
Off系统相反，存在四环素时，TetR与其TetO序列结合并诱导下游基因表达。
[0006]内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)已被广泛用于基因载体的构建中，IRES上游目的基因的翻译遵循真核生物蛋白翻译的规则，而下游的目的基因可通过IRES招募核糖体从而实现下游基因的翻译，使通过IRES 连接的上、下游两基因可同时并独立表达，解决了转基因领域中两个外源基因通过两个单独的载体共转染时的不稳定性及基因表达的水平的差异性等问题。

技术实现思路

[0007](一)专利技术目的
[0008]我们构建了一个新型自噬载体pIRES
‑
Rt
‑
sirt2
‑
Tet
‑
nap并应用到AD小鼠模型的体内实验，阐明了Rt
‑
sirt2治疗AD的效果，在有效控制外源基因在细胞内的高效表达的同时，为预防和治疗AD等线粒体功能障碍的疾病提供了新策略。
[0009](二)技术方案
[0010]为解决上述问题，本专利技术提出了利用四环素调控系统控制分子伴侣介导的自噬，将自噬肽段nap和四环素调控元件连接，再将其引入带有内部核糖体进入位点的质粒pIRES
‑
Rt
‑
sirt2，构建能高效表达粘红酵母重组sirt2蛋白的自噬载体，将其通过尾静脉注射到AD小鼠模型，进行小鼠脑组织中线粒体指标检测和动物行为学实验，以证明Sirt2蛋白对衰老疾病的治疗作用，包括以下步骤：
[0011]S1、在本专利技术中，我们将内部核糖体结合位点IRES引入表达载体中，成功构建了质粒载体pIRES
‑
Rt
‑
sirt2，其次，通过ProtParamtool及NCBI数据库分析成功设计并合成了DNA核酸自噬肽nap，由连接组蛋白H1与DNA结合的结构域和介导CMA自噬途径的识别基序组成，其核苷酸序列为(atg)tcg cag atc aag ttg tcc atc aag cgc ctg gtc acc aag ttc gag cgccag(tga)，氨基酸序列为“sqiklsikrlvtkferq”，等电点为pI：11.10，此外，我们将nap肽段克隆至四环素诱导调控系统的应答元件Tet
‑
on中，并将携带有nap肽段的整个Tet
‑
on诱导调控系统引入质粒pIRES
‑
Rt
‑
sirt2中，成功构建了自噬载体pIRES
‑
Rt
‑
sirt2
‑
Tet
‑
on；
[0012]S2、本专利技术将制备好的包裹有Rt
‑
sirt2自噬载体的阳离子脂质体通过尾静脉注射到AD模型小鼠体内，检测了AD模型小鼠脑组织中线粒体功能指标，并进行了动物行为学实验。结果表明，经转铁蛋白修饰的携带有Sirt2基因自噬载体的阳离子脂质体能成功穿过小鼠的BBB到达皮层和海马组织，且经Rt
‑
sirt2治疗后，AD模型小鼠皮层和海马组织中ATP含量及细胞色素c氧化(Cyt c)酶活性升高，ROS水平下降，线粒体功能得到改善；此外，mtDNA含量增多，相关转录因子表达水平上调，线粒体质量得到改善，进一步的检测发现，线粒体动力学蛋白及自噬蛋白的表达水平均得到不同程度的改善，这使得AD模型小鼠脑组织中受损的线粒体网络得到恢复，而这些结果改善了AD模型小鼠的学习和认知能力。总的来说，本实验证实了Rt
‑
sirt2可通过调节线粒体的生物发生来改善细胞内线粒体质量、功能及线粒体网络，以此来逆转AD模型小鼠脑组织中受损的线粒体功能，进而改善AD模型小鼠的学习及认知功能。
附图说明
[0013]图1为pIRES
‑
Rt
‑
sirt2
‑
Tet
‑
nap质粒图谱。
[0014]图2为Rt
‑
sirt2基因片段的PCR扩增电泳图，其中M:Marker，泳道1:Rt
‑
sirt2。
[0015]图3为大肠杆菌转化菌株中目的基因菌落PCR(左图)及质粒的双酶切(右图) 验证本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明构建了一种能恢复线粒体功能并改善阿尔兹海默症的pIRES
‑
Rt
‑
sirt2
‑
Tet
‑
nap重组自噬载体。2.权利要求1所述的pIRES
‑
Rt
‑
sirt2
‑
Tet
‑
nap重组自噬载体，其构建过程概括为：引入内部核糖体进入位点IRES以构建质粒IRES
‑
Rt
‑
sirt2质粒，再将连接组蛋白H1与DNA结合的结构域和介导CMA自噬途径的识别基序组成的DNA核酸自噬肽nap以及四环素可诱导(Tet
‑
on)系统引入质粒pIRES
‑
Rt
‑
sirt2，从而构建了质粒pIRES
‑
Rsirt2
‑
Tet
‑
nap。3.权利要求1所述的pIRES
‑
Rt
‑
sirt2
‑
Tet
‑
nap重组自噬载体，其特征在于：携带的DNA核酸自噬肽nap在体内外均可通过激活胞内分子伴侣介导自噬途径使携带有外源基因的载体发生自噬消亡，实现外源基因在体内/外...

【专利技术属性】
技术研发人员：利时雨，孙晗笑，孙含蓄，冯丽霞，邓建善，刘淑婷，钟志颖，耿程旭，
申请(专利权)人：广州弘润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：