【技术实现步骤摘要】
本专利技术属sirt3和sirt4双基因在线粒体功能障碍上进行的修复机制研究领域，更具体地说，本专利技术涉及sirt3和sirt4双基因通过多个酶蛋白的去乙酰化，使线粒体稳态得到恢复，为线粒体疾病的基因治疗提供新方法。
技术介绍
1、人体细胞的线粒体中缺乏dna修复机制，mtdna容易因应激反应损伤，最常见的是氧化应激。机体在进行氧化代谢时，线粒体中的etc容易因电子大量漏出使氧分子还原形成活性氧(reactive oxygen species,ros)，过多ros导致mtdna突变，引起线粒体功能障碍，影响线粒体稳态，引发各种疾病。
2、sirt3蛋白具有强大的nad+依赖性去乙酰酶活性，在维持线粒体氧化还原稳态、调节线粒体代谢、控制应激反应和维持线粒体基因组稳定上具有重要作用；sirt4拥有较强的adp-糖基转移酶活性，可以催化nad上的adp-核糖基转移到谷氨脱氢酶上，抑制谷氨酸向α-酮戊二酸的反应进而调节线粒体内部的稳态。
3、溴化乙锭(ethidium bromide，eb)是一种具有苯并三嗪刚性结构的化合物，能作为一种dna螯合剂插入并紧紧地结合到dna碱基对之间，使dna的复制和转录阻滞。eb插入到相邻碱基对之间使碱基间隔增加至0.7nm，容易导致dna分子碱基错配甚至移码突变，是一种相对理想mtdna缺陷型细胞模型构建的诱导剂。
4、质粒载体或病毒载体的构建是常见的sirt成员的基因治疗手段。将sirt3和sirt4基因构建一个有自噬特性的基因治疗载体psirt3/4-nap，
技术实现思路
1、本专利技术通过将sirt3和sirt4基因构建一个有自噬特性的基因治疗载体，通过筛选质粒转染到细胞后的差异基因，探究双基因自噬性质粒psirt3/4-nap对mtdna突变的细胞和线粒体功能障碍的作用靶点及修复方法。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.本专利技术通过sirt3和sirt4双基因诱导的多个酶去乙酰化作用，进行mtDNA突变的修复机制研究，首次提出多联糖基化酶修复机制(OG-TD-AA修复机制)。通过构建双基因自噬性质粒psirt3/4-NAP，采用溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)诱导mtDNA突变，首次验证了Sirt3和Sirt4蛋白能够通过对线粒体代谢相关蛋白的去乙酰化调控作用，提高TFAM、OGG1、TDG、MnSOD、CypD、ANT2、Parkin和PGC1-α酶的活性，修复T＞C和T＞A等错配碱基，使线粒体稳态得到恢复，是一种通过基因治疗手段修复突变mtDNA的方法。
2.权利要求1所述的TFAM、OGG1、TDG、MnSOD、CypD、ANT2、Parkin和PGC1-α酶，其特征在于，TFAM可以特异性识别线粒体基因组的轻链和重链启动子，启动mtDNA的转录；OGG1能够修复自发G:C向A:T的颠换突变；TDG通过水解DNA主链中错配的T碱基与核糖之间的N-糖苷键，从G:T错配中去除T，恢复成正常的G:C；MnSOD可以维持线粒体内正常的ROS水平；CypD和Par
3.权利要求1所述的一种双基因自噬载体psirt3/4-NAP，其特征在于，选用了携带内部核糖体结合位点IRES的母质粒pIRES2-EGFP，将sirt3和sirt4克隆在IRES的上下游，成功构建双基因表达质粒psirt3/4。然后再将在四环素Tet-on调控系统下表达的NAP自噬肽基因引入双基因质粒，构建成双基因自噬性质粒psirt3/4-NAP。
4.权利要求3所述的一种NAP序列，其特征在于，其表达后可以激活哺乳动物细胞特有的分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)，在本研究中，DOX的诱导可以使CMA发生的标志蛋白LAMP2A表达增加，以清除质粒DNA，而不影响巨自噬相关蛋白LC3以及微自噬相关蛋白Rab5，实现基因的安全可控表达。
5.权利要求1所述的一种EB诱导细胞mtDNA突变，其特征在于，EB能够作用于mtDNA而不会影响nDNA，导致mtDNA的碱基错配甚至移码，本专利技术以低浓度的EB作为诱导剂，将293T细胞成功诱导成以错义突变为主的mtDNA突变细胞模型，以T＞C、T＞A和A＞G为主。
6.权利要求1所述的一种线粒体稳态，其特征在于，线粒体稳态包括线粒体基因组、线粒体蛋白组和线粒体动力学的稳定与平衡。线粒体基因组稳定的通过3个防御体系维持，包括mtDNA的组织结构；线粒体内DNA修复机制；线粒体动力学过程；线粒体蛋白组的稳定由一系列分子伴侣、线粒体蛋白酶来检测和维持；线粒体动力学包括三种线粒体行为，即融合、分裂和线粒体自噬。
7.权利要求1所述的一种多联糖基化酶的去乙酰化修复突变mtDNA，提供碱基突变修复的新方法，用于线粒DNA突变的相关疾病治疗(糖尿病、神经退行性病、Leber遗传性视神经病变、线粒体脑肌病、人类神经性肌肉衰弱症等)。
...【技术特征摘要】
1.本发明通过sirt3和sirt4双基因诱导的多个酶去乙酰化作用，进行mtdna突变的修复机制研究，首次提出多联糖基化酶修复机制(og-td-aa修复机制)。通过构建双基因自噬性质粒psirt3/4-nap，采用溴化乙锭(ethidium bromide,eb)诱导mtdna突变，首次验证了sirt3和sirt4蛋白能够通过对线粒体代谢相关蛋白的去乙酰化调控作用，提高tfam、ogg1、tdg、mnsod、cypd、ant2、parkin和pgc1-α酶的活性，修复t＞c和t＞a等错配碱基，使线粒体稳态得到恢复，是一种通过基因治疗手段修复突变mtdna的方法。
2.权利要求1所述的tfam、ogg1、tdg、mnsod、cypd、ant2、parkin和pgc1-α酶，其特征在于，tfam可以特异性识别线粒体基因组的轻链和重链启动子，启动mtdna的转录；ogg1能够修复自发g:c向a:t的颠换突变；tdg通过水解dna主链中错配的t碱基与核糖之间的n-糖苷键，从g:t错配中去除t，恢复成正常的g:c；mnsod可以维持线粒体内正常的ros水平；cypd和parkin都是mptp孔的组件，其去乙酰化可以抑制mptp孔的开放；ant2可以线粒体内产生的atp供应给胞质，改善细胞内的atp稳态；pgc1-α是协调线粒体生物发生、细胞呼吸和能量代谢的主要介质。
3.权利要求1所述的一种双基因自噬载体psirt3/4-nap，其特征在于，选用了携带内部核糖体结合位点ires的母质粒pires2-egfp，将sirt3和sirt4克隆在ires的上下游...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，利时雨，耿承旭，程程，钟志颖，张丽君，
申请(专利权)人：广州弘润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。