一种增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法，通过ExpiCHO细胞的瞬时转染方法获得的混合ExpiCHO细胞悬液然后通过促进ExpiCHO细胞的瞬时转染后抗体表达的方法进行抗体表达。相对于传统的转染方法，通过采用上述方法可以获得更高Expicho细胞目的蛋白表达量。达量。达量。

【技术实现步骤摘要】
一种增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法。

技术介绍

[0002]生产高达毫克或克级的重组蛋白是许多科研团队与制药公司在临床前、生化、生物物理和药物研究的基本过程。哺乳动物细胞体系生产重组蛋白由于其具有能最佳的表达高分子量的蛋白质产物、使复杂结构的蛋白产生正确的折叠和给糖蛋白提供合适的翻译后修饰的功能而成为生物制药领域的表达重组蛋白的最佳选择。
[0003]传统的哺乳动物细胞表达体系是构建细胞稳定表达的将外源基因整合到宿主细胞染色体上的稳定株表达体系。构建稳定株表达体系生产重组蛋白需要在 DNA导入细胞后进行长时间的筛选，然后才能确定表达量高并且稳定的细胞株，这个过程通常需要几个月的时间并且花费大量的人力来完成。
[0004]CHO细胞(Chinese hamster ovary cell，l，中国仓鼠卵巢细胞)作为哺乳动物蛋白表达系统，被广泛地用来表达重组DNA的蛋白。例如ExpiCHO细胞在配套的ExpiCHO表达培养基中具有不成团，不聚集，并可以生长到非常高的细胞密度，通过瞬时转染可以产生更高的蛋白质产量。ExpiCHO细胞瞬时转染允许快速、高产量的瞬时蛋白质生产，允许实验室开发蛋白质生物治疗剂在药物开发过程中从CHO表达的蛋白质开始到完成。
[0005]随着生命科学和生物制药的飞速发展，大量的蛋白被用于基础研究和药物开发，急需一个能在短时间内就能得到重组蛋白的方法。基因瞬时表达应运而生，与稳定株表达体系不同，瞬时转染的外源DNA不整合到宿主细胞DNA中，其在细胞中的数目通常随着细胞的分裂而减少，因此蛋白表达只能维持几天到十几天的时间，但其优点是能在短短几天之内拿到基因的表达产物，而且其通用性强。然而，相对于构建稳定株表达体系来说，瞬时转染生产重组蛋白存在转染效率低、表达量低的缺点，使得此方法的应用受到较大的限制。此外，常用的CHO细胞的瞬时转染方法的转染效率较低，且转染后细胞中目的基因的表达产量较低，不能满足实际需求。因此怎样提高瞬时转染的效率、提高表达量成为日常操作成为亟待解决的问题。
[0006]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法，以解决现有技术的上述问题。
[0008]本专利技术的方案是：
[0009]一种增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法，通过ExpiCHO细胞的瞬时转染方法获得的混合ExpiCHO细胞悬液然后通过促进ExpiCHO细胞的瞬时转染后抗体表达的方法进行抗体表达。
[0010]作为优选的技术方案，ExpiCHO细胞的瞬时转染方法包括下列步骤：
[0011]1)在瞬时转染的前一天将ExpiCHO细胞传代培养，调整细胞密度至2
×ꢀ
106cells/ml,将含有一定体积细胞的摇瓶放入摇床中进行培养；
[0012]2)瞬时转染当天，所述ExpiCHO细胞计数，用新鲜培养基稀释调整细胞密度为4
×
106cells/ml，细胞活率在95％以上，得到ExpiCHO细胞悬液；
[0013]3)转染前的准备，将配置好的A液与B液，混匀后静置一段时间，得到混合滴液；
[0014]4)将所述混合滴液加入ExpiCHO细胞悬液中，按照细胞培养条件进行培养。
[0015]作为优选的技术方案，所述A液包括含抗体轻重链的质粒与PBS缓冲液，所述含抗体轻重链的质粒中包括含抗体轻链质粒与含抗体重链质粒的比例为 1:1，然后将所述含抗体轻重链的质粒与600μl的PBS缓冲液混合得到A液；所述B液包括PEI转染试剂与PBS缓冲液；所述抗体轻重链的质粒的总质粒量与所述的ExpiCHO细胞悬液的细胞数量比为20μg:4
×
107个细胞
‑
12
×
107个细胞；所述抗体轻重链的质粒的总质粒量与所述转染试剂的添加量的质量比为 1:2～1：6。
[0016]作为优选的技术方案，所述的ExpiCHO细胞要在转染的24小时内传代一次；所述摇瓶为传代时用250ml～1000ml规格的圆底摇瓶，转染时使用125ml规格的圆底摇瓶；所述步骤1)中一定体积为10ml、20ml、30ml其中的一种；所述步骤3)中静置的方法为室温不低于29℃的条件，静置时间为10～20分钟或所述静置为29℃静置水浴其中的一种；所述细胞传代培养与细胞培养的条件为 37℃，8％CO2，摇床速度为110rpm。
[0017]作为优选的技术方案，所述的抗体轻重链的总质粒量和所述的ExpiCHO细胞悬液的细胞数量比为20μg:8
×
107个细胞；抗体轻重链的质粒的总质粒量与所述转染试剂的添加量的质量比为1:4。
[0018]作为优选的技术方案，所述ExpiCHO细胞悬液还包括无血清培养基，所述无血清培养基为Transpro CD01，所述ExpiCHO细胞悬液包括转染前加入 4mmol/L～6mmol/L的谷氨酰胺。
[0019]作为优选的技术方案，促进ExpiCHO细胞的瞬时转染后抗体表达的方法包括如下步骤：
[0020]瞬时转染后得到重组ExpiCHO细胞，在转染后4～10小时进行降温培养，转染后12～24小时加入水解物，加入的水解物的量为3g/L～8g/L，促进转染细胞的蛋白表达。
[0021]作为优选的技术方案，所述水解物为植物蛋白水解物，所述植物蛋白水解物包括Bacto麦芽粉、BBL植物蛋白水解物、Difco精选大豆胨、Difco超滤酵母水解物、BBL酵母提取物、Bacto酵母提取物、Bacto酵母提取物、Oxoid一号植物蛋白胨、Oxoid非转基因大豆蛋白胨、大豆SE50MK
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NK、大豆SE50MK
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NK、大豆WGE80M
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UF超滤型、Kerry Hypep
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1510、Kerry Hypep
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4601N、Kerry Hypep
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YE 与Oxoid一号植物蛋白胨其中的一种或多种的混合物。
[0022]作为优选的技术方案，所述转染后培养18时，加入3g/L～8g/L的植物蛋白水解物；细胞转染后的所述降温培养条件为32℃，8％CO2，摇床速度为110rpm；所述植物蛋白水解物为Bacto酵母提取物、Kerry Hypep
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1510与Difco超滤酵母水解物的混合物，其中Bacto酵母提取物5g/L、Kerry Hypep
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1510 3g/L、 Difco超滤酵母水解物6g/L。
[0023]一种ExpiCHO细胞的瞬时转染方法在重组蛋白表达中的应用。
[0024]由于采用了上述技术方案一种增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法，通过
ExpiCHO细胞的瞬时转染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法，其特征在于：通过ExpiCHO细胞的瞬时转染方法获得的混合ExpiCHO细胞悬液然后通过促进ExpiCHO细胞的瞬时转染后抗体表达的方法进行抗体表达。2.如权利要去1所述增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法，其特征在于，ExpiCHO细胞的瞬时转染方法包括下列步骤：1)在瞬时转染的前一天将ExpiCHO细胞传代培养，调整细胞密度至2
×
106cells/ml,将含有一定体积细胞的摇瓶放入摇床中进行培养；2)瞬时转染当天，所述ExpiCHO细胞计数，用新鲜培养基稀释调整细胞密度为4
×
106cells/ml，细胞活率在95％以上，得到ExpiCHO细胞悬液；3)转染前的准备，将配置好的A液与B液，混匀后静置一段时间，得到混合滴液；4)将所述混合滴液加入ExpiCHO细胞悬液中，按照细胞培养条件进行培养。3.如权利要求2所述的所述增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法，其特征在于：所述A液包括含抗体轻重链的质粒与PBS缓冲液，所述含抗体轻重链的质粒中包括含抗体轻链质粒与含抗体重链质粒的比例为1:1，然后将所述含抗体轻重链的质粒与600μl的PBS缓冲液混合得到A液；所述B液包括PEI转染试剂与PBS缓冲液；所述抗体轻重链的质粒的总质粒量与所述的ExpiCHO细胞悬液的细胞数量比为20μg:4
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107个细胞
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12
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107个细胞；所述抗体轻重链的质粒的总质粒量与所述转染试剂的添加量的质量比为1:2～1：6。4.如权利要求2所述的所述增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法，其特征在于：所述的ExpiCHO细胞要在转染的24小时内传代一次；所述摇瓶为传代时用250ml～1000ml规格的圆底摇瓶，转染时使用125ml规格的圆底摇瓶；所述步骤1)中一定体积为10ml、20ml、30ml其中的一种；所述步骤3)中静置的方法为室温不低于29℃的条件，静置时间为10～20分钟或所述静置为29℃静置水浴其中的一种；所述细胞传代培养与细胞培养的条件为37℃，8％CO2，摇床速度为110rpm。5.如权利要求2所述的所述增强ExpiCHO细胞瞬时转染抗体表达的方法，其特征在于：所述的抗体轻重链的总质粒量和所述的ExpiC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王龙，姚芸，王猛，
申请(专利权)人：无锡多宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：