活细胞核糖体RNA可视化系统及其用途技术方案

本发明专利技术公开了一种活细胞核糖体RNA可视化系统及其用途。具体地说，本发明专利技术建立了一个靶向rRNA生成的高效筛选系统，该筛选系统基于本发明专利技术新开发的活细胞rRNA荧光报告分子。该系统和传统的筛选策略相比，能够极大简化筛选流程，节省筛选时间，因此显著地提高了筛选效率。因此显著地提高了筛选效率。因此显著地提高了筛选效率。

【技术实现步骤摘要】
活细胞核糖体RNA可视化系统及其用途


[0001]本专利技术属于分子生物学和生物医药领域，具体地，本专利技术涉及核糖体RNA可视化系统及其用途。

技术介绍

[0002]核糖体生成的关键步骤在核仁中进行，rDNA转录产生47S pre
‑
rRNA,再通过剪切加工生成三种核糖体RNA,分别为18S、5.8S和28S，与其他组分一起组装成核糖体大小亚基，转运至细胞质最终形成核糖体，作为蛋白质合成的工厂。核糖体与细胞的生长、增殖、分化、细胞寿命、胚胎发育、神经退行以及癌症的发生有关。核仁的增大及数量增多长期以来被作为肿瘤细胞的典型特征之一。这个显著特征是由于RNA聚合酶I(Pol I)的过度激活，从而产生大量核糖体RNA(rRNA)，支持肿瘤细胞的快速生长与增殖。核糖体生成的限速步骤是Pol I合成rRNA。
[0003]癌症现如今已经成为现代社会的常见疾病，但人们对于如何治疗癌症，仍在不断的探索之中。人们已经对癌症进行了大量研究，对癌症的了解不断加深，同时，开发了多种治疗癌症的方法，比如小分子药物，抗体和免疫治疗法。肿瘤的本质是多基因突变且复杂多样的疾病，在分子遗传上有高度的异质性，其基因组具有不稳定性。随着肿瘤细胞不断进行分裂和增殖，基因组突变仍在不断积累。这些特性造成肿瘤治疗的主要挑战和瓶颈。靶向药物是肿瘤疗法和药物发展的主要方向之一，这种治疗策略比传统的化疗药物疗效好，副作用也减小。然而，治疗癌症的一个主要障碍是耐药性。肿瘤细胞随着不断分裂和增殖总在不断地积累基因突变，使得它们发展出新的逃逸机制。因此发展出一种对肿瘤细胞更为致命，靶向各种肿瘤类型更有普适性的靶向治疗策略刻不容缓。“非个性化治疗”或许才是肿瘤治疗的希望。靶向核糖体产生的策略可以说正是这样一种思路。
[0004]核糖体生物发生的调控有多个步骤，包括rRNA的转录和加工、核糖体蛋白质的合成和核糖体的组装，这些都是潜在的抑制细胞增殖的靶点。由于大多数促生长信号会基于超活化的Pol I转录，对其活性的特异性抑制提供了一个特殊的治疗机会。通过抑制Pol I转录来减少核糖体生成可能成为肿瘤治疗的有效策略，其具有几点优势：1)Pol I在细胞内专一性介导rRNA前体转录，即47S rRNA前体；2)核糖体生成的异常出现在大多数肿瘤细胞类型中，因此Pol I转录抑制剂具有治疗多种癌症的潜力；3)健康体细胞核糖体生成水平较低，它们对Pol I抑制剂的敏感性降低。因此有望鉴定选择性抑制肿瘤细胞内的Pol I活性而不影响正常细胞的小分子。基于这一研究思路，通过实时荧光定量PCR或Northern印迹杂交的形式检测rRNA的表达变化，已经有三种抗癌小分子抑制剂被鉴定，包括BMH
‑
21，CX
‑
5461和CX
‑
3543。其中CX
‑
5461已经进入临床实验阶段。但是，常规的实时荧光定量PCR或Northern印迹杂交技术，筛选流程复杂、筛选周期长，而且很难完成大规模高通量筛选。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种核糖体RNA可视化系统及其用途。
[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种基因工程细胞，所述基因工程细胞的rDNA中整合有外源DNA序列，所述外源DNA序列编码RNA标记序列，在rDNA转录时所述RNA标记序列成为rRNA的一部分。RNA序列包含若干个茎环重复序列，结合多个拷贝的RNA结合蛋白，从而在每个rRNA分子富集足够强的荧光信号用于可视化检测。
[0007]在另一优选例中，所述RNA标记序列为MS2序列单元、PP7序列单元、boxB序列单元。
[0008]在另一优选例中，所述外源DNA在所述rDNA的插入位点选自：5
’
ETS区域、18S区域、ITS1区域、5.8S区域、ITS2区域、28S区域、或3
’
ETS区域；优选为5
’
ETS区域、ITS1区域、5.8S区域、或3
’
ETS区域；更优选为5.8S区域。
[0009]在另一优选例中，所述RNA标记序列至少包括6个RNA茎环重复序列；优选地，至少包括12个茎环重复序列；更优选地，至少包括17个茎环重复序列。
[0010]在另一优选例中，所述MS2序列单元至少包括6个MS2重复序列；优选地，至少包括12个MS2重复序列；更优选地，至少包括17个MS2重复序列。
[0011]在另一优选例中，所述PP7序列单元至少包括6个PP7重复序列；优选地，至少包括12个PP7重复序列；更优选地，至少包括17个PP7重复序列。
[0012]在另一优选例中，所述boxB序列单元至少包括6个boxB重复序列；优选地，至少包括12个boxB重复序列；更优选地，至少包括17个boxB重复序列。
[0013]在另一优选例中，所述基因工程细胞还表达与所述RNA标记序列特异性结合的RNA结合蛋白。
[0014]在另一优选例中，所述RNA结合蛋白连接有报告分子；优选地，所述报告分子为荧光蛋白或荧光素。
[0015]在另一优选例中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白(如tdTomato、DsRed、mCherry)、绿色荧光蛋白(如eGFP、ZsGreen)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白基因(CFP)等。
[0016]在另一优选例中，当所述RNA标记序列为MS2序列单元时，所述RNA结合蛋白为MCP蛋白。
[0017]在另一优选例中，当所述RNA标记序列为PP7序列单元时，所述RNA结合蛋白为PCP蛋白。
[0018]在另一优选例中，当所述RNA标记序列为boxB序列单元时，所述RNA结合蛋白为λ
‑
N蛋白。
[0019]在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞，优选为HEK293细胞、或者Hela等肿瘤细胞。
[0020]在另一优选例中，所述基因工程细胞为单克隆细胞株。
[0021]本专利技术的第二方面，提供了一种用于基因敲入的核酸构建物，所述核酸构建物的结构如式I或式II所示，
[0022]S
‑
M
‑
S，
ꢀꢀꢀꢀꢀ
式I
[0023]S
‑5’
HA
‑
M
‑3’
HA
‑
S,
ꢀꢀꢀ
式II
[0024]式I中，S元件为能被Cas9蛋白识别剪切的靶序列，M元件为供体序列；各
“‑”
为键或连接序列；
[0025]式II中，S元件为能被Cas9识别剪切的靶序列，M元件为供体序列；5
’
HA元件为所述
供体序列拟插入的基因组靶位点5
’
端的同源臂，3
’
HA元件为所述供体序列拟插入的基因组靶位点3
’
端的同源臂，各
“‑”
为键或连接本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞的rDNA中整合有外源DNA序列，所述外源DNA序列编码RNA标记序列，在rDNA转录时所述RNA标记序列成为rRNA的一部分。2.如权利要求1所述的基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞还表达与所述RNA标记序列特异性结合的RNA结合蛋白。3.如权利要求2所述的基因工程细胞，其特征在于，所述RNA结合蛋白连接有报告分子；优选地，所述报告分子为荧光蛋白或荧光素。4.一种用于基因敲入的核酸构建物，所述核酸构建物的结构如式I或式II所示，S
‑
M
‑
S，
ꢀꢀꢀ
式IS
‑5’
HA
‑
M
‑3’
HA
‑
S,
ꢀꢀꢀ
式II式I中，S为能被Cas9蛋白识别剪切的靶序列，M为供体序列；各
“‑”
为键或连接序列；式II中，S为能被Cas9识别剪切的靶序列，M为供体序列；5
’
HA为所述供体序列拟插入的基因组靶位点5
’
端的同源臂，3
’
HA为所述供体序列拟插入的基因组靶位点3
’
端的同源臂，各
“‑”
为键或连接序列。5.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒含有权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宝惠，扶玉娟，邹炜，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：