一种肝细胞-胆管细胞混合型肝癌小鼠模型及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种肝细胞

【技术实现步骤摘要】
一种肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型及其构建方法


[0001]本专利技术涉及一种肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型及其构建方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)作为癌症相关死亡的第三大原因，主要包括三种类型：肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌(cHCC
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ICC)。近年的研究表明，ICC和HCC具有双向表型分化的单克隆来源，而cHCC
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ICC作为一种罕见的原发性肝癌，仅占PLC的0.4％～14.2％。由于cHCC
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ICC的诊断依赖于组织学发现的证据，不宜切除的患者可能被误诊为HCC或ICC，因此低估了当前cHCC
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ICC发病率。虽然根治性手术切除或肝移植被认为是cHCC
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ICC主要的临床治疗方法，但由于cHCC
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ICC往往出现淋巴结转移和血管侵犯，有超过80％的患者在5年内复发。不幸的是，由于治疗方案的匮乏，无法切除的cHCC
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ICC患者的5年生存率不超过30％。因此，需要深入了解cHCC
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ICC的分子病理学并挖掘潜在的治疗靶点。
[0003]与异种移植肿瘤模型相比，基因工程产生的肿瘤模型与临床的肿瘤患者在组织病理学特征中更加相似。水流动力学尾静脉高压注射法和肝脏原位电穿孔转染法是将外源质粒DNA直接转染进入肝细胞的两种方法。水流动力学尾静脉高压注射法通过产生较强的血液流体压力，强迫血流导向至肝脏，在高压血流下肝细胞膜肿胀并出现小孔，使质粒DNA通过这些小孔进入肝细胞，并在转座子系统的引导下整合进入细胞基因组，从而使外源质粒DNA发生转录。水流动力学尾静脉高压注射法的缺点在于并不能够使质粒DNA完全进入肝脏，导致其产生的肿瘤因小鼠个体差异而不均一，同时该方法产生的自发性肝癌为弥漫性生长，不利于后续的统计分析和实验研究。利用电转仪进行的肝脏原位电传染法是将外源质粒DNA直接导入肝细胞的有效方法，其转染效率高，转染位置固定，所转染的外源质粒DNA将全部进入肝脏，产生为单发的自发性肝癌，有利于于后续的统计分析和实验研究。目前，已有通过水流动力学尾静脉高压注射法和肝脏原位电穿孔转染法构建小鼠的自发性肝细胞肝癌和胆管细胞癌，但肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型的构建仍有待开发。
[0004]为了适应临床和科研需要，亟需一种新的肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型构建方法，所建立的模型适用于实验研究和药物筛选，同时还具有制作过程简单易行，操作所致小鼠死亡率低，成功率高、易于推广的特点。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种模拟人类临床肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌分子遗传学背景和肿瘤生物学特性的小鼠模型及其活性功能组织，用于深入了解cHCC
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ICC的分子病理学并挖掘潜在的治疗靶点，同时可以满足医药市场以及研究机构的需求。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型的
活性功能组织，所述小鼠模型的活性功能组织为小鼠肝脏原位经过质粒电穿孔转染成瘤得到的小鼠模型的肿瘤组织，所述肿瘤组织的H&E染色结果为：肿瘤组织中的上皮细胞紊乱，有丝分裂激活，核多形性异常，细胞极性丧失，肿瘤组织中观察到胆管样组织；所述肿瘤组织的IHC染色结果为：肿瘤组织中肝细胞特异性标记物肝细胞核因子4
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α(HNF4α)和胆管分化标记物细胞角蛋白19(CK
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19)表达阳性。
[0007]优选地，所述质粒包括pT/Caggs
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cMyc
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AKT1，PX330
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sg，和p53+SB13；所述质粒pT/Caggs
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cMyc
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AKT1是由c
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Myc和AKT1基因克隆进入pT/Caggs载体所获得的质粒。
[0008]优选地，所述的小鼠为野生型C57BL/6小鼠。
[0009]本专利技术还提供了一种肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：准备用于构建小鼠模型的质粒pT/Caggs
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cMyc
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AKT1+PX330
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sg p53+SB13，将其配制成质粒溶液，使用电转染仪将质粒在小鼠肝脏原位进行电转染，常规饲养，得到小鼠肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型。
[0010]优选地，所述质粒pT/Caggs
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cMyc
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AKT1是由c
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Myc和AKT1基因克隆进入pT/Caggs载体所获得的质粒；所述质粒溶液的配制方法包括：将pT/Caggs
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cMyc
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AKT质粒40μg，PX330
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sg p53质粒40μg和SB13质粒10μg加入50μL无菌的0.9％生理盐水，得到质粒溶液。
[0011]本专利技术还提供了上述的肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型的活性功能组织的应用，所述应用选自：
[0012]a)用于研究肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌发生、发展的机理；
[0013]b)筛选或评估治疗肝细胞
‑
胆管细胞混合型肝癌的药物；
[0014]c)筛选肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌相关生物标志物或鉴定分子靶点；或
[0015]d)研究肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌耐药机制。
[0016]本专利技术还提供了上述的肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型的构建方法构建得到的小鼠模型的应用，所述应用选自：
[0017]a)用于研究肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌发生、发展的机理；
[0018]b)筛选或评估治疗肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌的药物；
[0019]c)筛选肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌相关生物标志物或鉴定分子靶点；或
[0020]d)研究肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌耐药机制。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0022]本专利技术使用电转仪将外源质粒DNA直接在小鼠肝脏原位进行电转染，由外源DNA转录导致的自发性肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌忠实地还原人类肝细胞
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型的活性功能组织，其特征在于，所述小鼠模型的活性功能组织为小鼠肝脏原位经过质粒电穿孔转染成瘤得到的小鼠肿瘤组织，所述肿瘤组织的H&E染色结果为：肿瘤组织中的上皮细胞紊乱，有丝分裂激活，核多形性异常，细胞极性丧失，肿瘤组织中观察到胆管样组织；所述肿瘤组织的IHC染色结果为：肿瘤组织中肝细胞特异性标记物肝细胞核因子4
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α和胆管分化标记物细胞角蛋白19表达阳性。2.如权利要求1所述的肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型的活性功能组织，其特征在于，所述质粒包括pT/Caggs
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cMyc
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AKT1，PX330
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sg，和p53+SB13；所述质粒pT/Caggs
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cMyc
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AKT1是由c
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Myc和AKT1基因克隆进入pT/Caggs载体所获得的质粒。3.如权利要求1所述的肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型的活性功能组织，其特征在于，所述的小鼠为野生型C57BL/6小鼠。4.一种肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：准备用于构建小鼠模型的质粒pT/Caggs
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cMyc
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AKT1+PX330
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sg p53+SB13，将其配制成质粒溶液，使用电转染仪将质粒在小鼠肝脏原位进行电转染，常规饲养，得到小鼠肝细胞
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胆管细胞混合型肝癌小鼠模型...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝继敏，孙嘉磊，董玲，刘韬韬，沈锡中，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：