本发明专利技术涉及一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法，本发明专利技术采用水溶性CdTe QDs为化学发光试剂，特定浓度、特定pH的KMnO4的PBS溶液作为激发剂，构建纳米粒子发光的CdTe QDs/KMnO4化学发光体系，基于半自动化测试方式实现TSH的超快速与高灵敏检测，达到单分子检测水平。达到单分子检测水平。达到单分子检测水平。
【技术实现步骤摘要】
一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法
[0001]本专利技术涉及一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法，属于化学发光免疫分析
技术介绍
[0002]在新型冠状病毒疫情不断侵袭的情况下，病毒的超快速、高灵敏检测已成大趋势。目前实用型新冠检测手段主要通过核酸扩增技术实现，耗时长且装置复杂。作为一种具有高灵敏度、高特异性、线性范围宽和仪器设备简单等优点体外诊断技术，化学发光免疫分析（CLIA）已在体外诊断领域取代传统的酶联免疫分析，正在商业化免疫分析领域获得广泛应用。商业化CLIA均采用分子型发光物作为标记物，在分析测定过程中仅能实施分子反应型化学发光，如，鲁米诺、吖啶酯和金刚烷等。由于分子型发光试剂只能参与一次化学发光反应，辐射信号弱，现阶段商业化CLIA尚不能实现对目标物的高灵敏与超快速测定。
[0003]量子点(QDs)是一类尺寸在1
‑
20 nm之间、由IV、II
‑
VI，IV
‑
VI或III
‑
V元素组成的纳米材料。量子点能够被激发光反复激发、产生强光致发光，自1998年以来一直是光致发光探针的明星材料(Science, 1998, 281, 2016)，已在荧光型生化分析与单分子检测领域获得了广泛应用(Coord. Chem. Rev. 2014, 263, 86. )。量子点作为化学发光试剂与发光体的研究始于2004年(Nano Lett. 2004, 4, 693)，并于近年来开始被用做化学发光免疫分析的标记物。然而受检测条件与实验技术等原因的限制，以量子点为发光试剂的CLIA的检测时间通常大于1小时，与个体化医疗中应有的“快速”的特性不符，检测灵敏度亦尚未达到高灵敏乃至单分子检测水平。
[0004]开发一种超快速与高灵敏化学发光免疫分析方法，同时不降低检测稳定性颇为重要。
技术实现思路
[0005]为了克服现有技术的不足，尤其是当前CLIA难以实现对目标物的高灵敏与超快速检测的局限性，本专利技术提供一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法。
[0006]本专利技术采用水溶性CdTe QDs为化学发光试剂，特定浓度、特定pH的 KMnO4的PBS溶液作为激发剂，构建纳米粒子发光的CdTe QDs/ KMnO4化学发光体系，实施对目标物的超快速与高灵敏检测，达到了传统化学发光免疫分析难以企及的单分子检测水平，该检测方法检测时间特别短，检测时间小于等于6min，可以以超快的速度实现促甲状腺激素的检测，同时具有高灵敏性，检测范围宽，检测限低。
[0007]术语说明：TSH：促甲状腺激素，英文名thyroid stimulating hormone，简称TSH。
[0008]一抗（TSH
‑
Ab1）：本专利技术一抗（Ab1）指生物素标记的促甲状腺激素抗原 (TSH) 的对
应抗体，本专利技术对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
[0009]二抗（TSH
‑
Ab2）：本专利技术二抗指TSH抗原和一抗的对应二抗。
[0010]EDC：1
‑
（3
‑
二甲基氨基丙基）
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐，英文名为1
‑
（3
‑
Dimethylaminopropyl）
‑
ethylcarbodiimide hydrochloride，简称EDC。
[0011]NHS：N
‑
羟基丁二酰亚胺，英文名为1
‑
Hydroxypyrrolidine
‑
2，5
‑
dione，简称NHS。
[0012]MCE：β
‑
巯基乙醇，又名2
‑
巯基乙醇，英文名为β
‑
Mercaptoethanol，简称MCE。
[0013]PBS：磷酸盐缓冲溶液的简称，主要成分包括K2HPO4、KH2PO4、KCl。
[0014]PBST：磷酸盐吐温缓冲溶液的简称，主要成分包括K2HPO4、KH2PO4、KCl、Tween
‑
20。
[0015]本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法，检测时间小于等于6min，包括步骤如下：（1）免疫复合物的制备1）纯化后的水溶性CdTe NCs复溶于PBST溶液中，得到CdTe NCs分散液，向分散液中加入含有EDC和NHS的溶液活化羧基10
‑
15分钟，加入稀释后的MCE，室温下反应4
‑
8分钟，反应后加入TSH二抗溶液，混匀，孵育1
‑
4h，甘氨酸封闭，除去未连接的量子点和TSH二抗，得到CdTe QDs标记的TSH二抗，分散于PBST溶液中，得到CdTe QDs标记的TSH二抗溶液；2）向链霉亲和素标记的磁珠溶液中加入生物素化TSH一抗溶液，震荡反应，清洗后复溶于PBST溶液，得到连接TSH一抗的磁珠溶液；3）将CdTe QDs标记的TSH二抗溶液、连接TSH一抗的磁珠溶液与标准已知浓度的TSH抗原溶液混合反应，得到免疫复合物溶液；（2）将免疫复合物溶液置于磁场中磁分离，加入KMnO4的PBS溶液作为激发液，KMnO4的浓度为1
‑
3 mmol/L，使用NRM
‑
CL
‑
200半自动化学发光仪采集化学发光信号，绘制化学发光信号和抗原浓度的标准曲线；（3）以待测目标TSH抗原替换标准已知浓度的TSH抗原溶液，按步骤（1）的方法构建免疫复合物，然后按步骤（2）的方法进行测试，得到目标电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上最高光强和步标准曲线，得到待测样品溶液中的TSH抗原。
[0016]根据本专利技术优选的，步骤1）中，PBST溶液为1 mL pH= 7.4，浓度为10 mmol/L的PBST溶液，CdTe NCs分散液的浓度为0.5
‑
3 μmol/L。
[0017]根据本专利技术优选的，步骤1）中，含有EDC和NHS的溶液为20 μL 100 mg/mL EDC溶液与20 μL 100 mg/mL NHS溶液混合的混合液。
[0018]根据本专利技术优选的，步骤1）中，稀释后的MCE的浓度为1
‑
2mol/L，稀释后的MCE的加入量为1
‑
5μL。
[0019]根据本专利技术优选的，步骤1）中，TSH二抗溶液的浓度为5
‑
15 μg/mL，最为优选的，TSH二抗溶液的浓度为10μg/mL；溶剂为pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液。
[0020]根据本专利技术优选的，步骤1）中，TSH二抗溶液的加入量为40
‑
70μL，最为优选的，TSH二抗溶液的加入量为50μL，所述孵育本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法，其特征在于，检测时间小于等于6min，包括步骤如下：（1）免疫复合物的制备1）纯化后的水溶性CdTe NCs复溶于PBST溶液中，得到CdTe NCs分散液，向分散液中加入含有EDC和NHS的溶液活化羧基10
‑
15分钟，加入稀释后的MCE，室温下反应4
‑
8分钟，反应后加入TSH二抗溶液，混匀，孵育1
‑
4h，甘氨酸封闭，除去未连接的量子点和TSH二抗，得到CdTe QDs标记的TSH二抗，分散于PBST溶液中，得到CdTe QDs标记的TSH二抗溶液；2）向链霉亲和素标记的磁珠溶液中加入生物素化TSH一抗溶液，震荡反应，清洗后复溶于PBST溶液，得到连接TSH一抗的磁珠溶液；3）将CdTe QDs标记的TSH二抗溶液、连接TSH一抗的磁珠溶液与标准已知浓度的TSH抗原溶液混合反应，得到免疫复合物溶液；（2）将免疫复合物溶液置于磁场中磁分离，加入KMnO4的PBS溶液作为激发液，KMnO4的浓度为1
‑
3 mmol/L，使用NRM
‑
CL
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200半自动化学发光仪采集化学发光信号，绘制化学发光信号和抗原浓度的标准曲线；（3）以待测目标TSH抗原替换标准已知浓度的TSH抗原溶液，按步骤（1）的方法构建免疫复合物，然后按步骤（2）的方法进行测试，得到目标电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上最高光强和步标准曲线，得到待测样品溶液中的TSH抗原。2.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析方法，其特征在于，步骤1）中，PBST溶液为1 mL pH= 7.4，浓度为10 mmol/L的PBST溶液，CdTe NCs分散液的浓度为0.5
‑
3 μmol/L；含有EDC和NHS的溶液为20 μL 100 mg/mL EDC溶液与20 μL 100 mg/mL NHS溶液混合的混合液；稀释后的MCE的浓度为1
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2mol/L，稀释后的MCE的加入量为1
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5μL；TSH二抗溶液的浓度为5
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15 μg/mL，溶剂为pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液；TSH二抗溶液的加入量为40
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70μL，所述孵育为37 ℃下反应2小时，利用TSH二抗上的氨基与量子点上活化的羧基偶联；甘氨酸封闭为加入10 μL 1%的甘氨酸封闭羧基活化位点2
‑
3小时，离心，使用pH= 7.4，浓度为10 mmol/L的PBST溶液洗涤3次除去未连接的量子点和TSH二抗。3.根据权利要求2所述的化学发光免疫分析方法，其特征在于，步骤1）中，PBS缓冲溶液的配置方法如下：称取0.1867 g K2HPO4、0.0259 g KH2PO4和0.0749 g KCl溶于100 mL去离子水中配制成pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹桂征，任校萱，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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