一种血清中叶酸和5-甲基四氢叶酸的血药浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及血药浓度测定方法技术领域，且公开了血清中叶酸和5

【技术实现步骤摘要】
一种血清中叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸的血药浓度测定方法


[0001]本专利技术涉及血药浓度测定方法
，具体为一种血清中叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸的血药浓度测定方法。

技术介绍

[0002]血药浓度是指药物吸收后在血浆内的总浓度，包括与血浆蛋白结合的或在血浆游离的药物，有时也可泛指药物在全血中的浓度，药物作用的强度与药物在血浆中的浓度成正比，药物在体内的浓度随着时间而变化。
[0003]目前在对患者血清中叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸的血药浓度进行测定时，其过程较为复杂，而且准确性较低，影响测定的数据精准性。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种血清中叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸的血药浓度测定方法，具备快速、准确、灵敏度高的液质联用方法，用于测定患者血清中叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸的血药浓度等优点，解决了血清中叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸的血药浓度测定慢和准确度不高的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]血清中叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸的血药浓度测定方法，包括以下步骤：
[0009]S1、样本的采用
[0010]采用2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液与叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸标品进行混合，高度模拟临床真实样本；
[0011]S2、性能参数
[0012]检测限(LOD)：叶酸：1ng/mL；
[0013]5‑
甲基四氢叶酸：1ng/mL；
[0014]测定低限(LOQ)：叶酸：2ng/mL；
[0015]5‑
甲基四氢叶酸：2ng/mL；
[0016]线性范围：叶酸：2ng/mL
‑
100ng/mL；
[0017]5‑
甲基四氢叶酸：2ng/mL
‑
100ng/mL；
[0018]方法验证时，回收率和精密度的要求：回收率为85％
‑
115％，精密度(日内精密度、日间精密度、仪器精密度)为RSD<15％；
[0019]稳定性：(储备液长期稳定性、模拟样品处置前室温放置4h稳定性、模拟样品处置后4℃放置24h稳定性、模拟样品反复冻融3次稳定性、模拟样品
‑
80℃长期存放稳定性)；
[0020]S3、原始样本系统
[0021]样本类型为血清，其样本采集通过采血针采集静脉全血，全血离心(3500r/min，
10min)，取上清即得血清，样本保存在
‑
80℃保存容器中；
[0022]S4、空白血清的来源
[0023]因叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸是内源性物质，本实验采取用替代基质来做标准曲线和质控样品，替代基质为2％小牛血清白蛋白的生理盐水溶液，生理盐水为自己配制的；
[0024]S5、所需试剂
[0025]S5.1、水：超纯水，由实验室Poll超纯水仪所制；
[0026]乙腈、甲醇、乙醇、甲酸、25mol/L氢氧化钠：质谱级，Fisher公司；
[0027]溶液如下：
[0028]流动相：0.05％甲酸水溶液(A)—乙腈(B)；
[0029]S5.2、标准品与各种溶液
[0030]所用溶液的配制：精密称取叶酸标品2.822mg，乘以纯度系数92.3％，用5％NaOH(0.1mol/L)20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mg/mL的叶酸储备液，于
‑
20℃冰箱中保存备用，精密称取5
‑
甲基四氢叶酸钙标品2.260mg，除以校正因子后，用5％NaOH(0.1mol/L)20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mg/mL的5
‑
甲基四氢叶酸储备液，于
‑
20℃冰箱中保存备用；
[0031]内标母液与工作液的配制：
[0032]精密称取甲氨喋呤标品2.147mg，用5％NaOH(0.1mol/L)20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mg/mL的甲氨喋呤储备液，于
‑
20℃冰箱中保存备用；
[0033]精密移取上述配制好的甲氨喋呤母液0.02mL，置于1.5mL离心管中，加入0.98mL甲醇：水(1:1；v:v)稀释，混匀，得浓度为10000ng/mL的甲氨喋呤内标溶液1；再次精密移取0.01mL甲氨喋呤内标溶液1，置于1.5mL离心管中，加入0.99mL甲醇：水(1:1；v:v)稀释，混匀，得浓度为100ng/mL的甲氨喋呤内标溶液2；
[0034]内标工作液即沉淀剂，为甲氨喋呤浓度为2ng/mL的甲醇溶液(0.1mg/mL VC)；
[0035]取10μL维生素C储备液，20μL甲氨喋呤内标溶液2(100ng/mL)加入到970μL的甲醇中，即沉淀剂；
[0036]维生素C溶液的配制：
[0037]精密称取一定量的维生素C，用超纯水配制成浓度为10mg/mL维生素C储备液，于
‑
20℃冰箱中保存备用，取10μL维生素C储备液，加入到990μL的水中，涡旋得到0.1mg/mL的维生素C工作液；
[0038]9％氯化钠水溶液的配制：
[0039]精密称取一定量的氯化钠，用超纯水配制成浓度为0.9％氯化钠水溶液，于4℃冰箱中保存备用；
[0040]标准曲线工作稀释液和复溶液(10％乙腈水(含0.1mg/mL VC)：
[0041]取10μL维生素C储备液，100μL纯乙腈，加入到890μL的水中，涡旋得到标准曲线工作稀释液和复溶液；
[0042]S5.3、质控样品工作溶液的配制
[0043]分别精密移取配制好的叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸母液0.02mL至1.5mL离心管中，加入0.96mL的10％乙腈水溶液(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释，得浓度为10000ng/mL的混合质控工作液1；
[0044]HQC工作液：精密移取配制好的，质控工作液1，0.160mL至1.5mL离心管中，加入
0.840mL的10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释，得浓度为1600ng/mL的混合质控工作液2，此溶液为高浓度质控工作液；
[0045]MQC工作液：精密移取配制好的质控工作液2，0.5mL至1.5mL离心管中，加入0.5mL的10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释，得浓度为800ng/mL的混合质控工作液3，此溶液为中浓度质控工作液；
[0046]精密移取配制好的质控工作液3，0.5mL至1.5mL离心管中，加入0.5mL的10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释，得浓度为400本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.血清中叶酸和5
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甲基四氢叶酸的血药浓度测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、样本的采用采用2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液与叶酸和5
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甲基四氢叶酸标品进行混合，高度模拟临床真实样本；S2、性能参数检测限(LOD)：叶酸：1ng/mL；5
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甲基四氢叶酸：1ng/mL；测定低限(LOQ)：叶酸：2ng/mL；5
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甲基四氢叶酸：2ng/mL；线性范围：叶酸：2ng/mL
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100ng/mL；5
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甲基四氢叶酸：2ng/mL
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100ng/mL；方法验证时，回收率和精密度的要求：回收率为85％
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115％，精密度(日内精密度、日间精密度、仪器精密度)为RSD<15％；稳定性：(储备液长期稳定性、模拟样品处置前室温放置4h稳定性、模拟样品处置后4℃放置24h稳定性、模拟样品反复冻融3次稳定性、模拟样品
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80℃长期存放稳定性)；S3、原始样本系统样本类型为血清，其样本采集通过采血针采集静脉全血，全血离心(3500r/min，10min)，取上清即得血清，样本保存在
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80℃保存容器中；S4、空白血清的来源因叶酸和5
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甲基四氢叶酸是内源性物质，本实验采取用替代基质来做标准曲线和质控样品，替代基质为2％小牛血清白蛋白的生理盐水溶液，生理盐水为自己配制的；S5、所需试剂S5.1、水：超纯水，由实验室Poll超纯水仪所制；乙腈、甲醇、乙醇、甲酸、25mol/L氢氧化钠：质谱级，Fisher公司；溶液如下：流动相：0.05％甲酸水溶液(A)—乙腈(B)；S5.2、标准品与各种溶液所用溶液的配制：精密称取叶酸标品2.822mg，乘以纯度系数92.3％，用5％NaOH(0.1mol/L)20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mg/mL的叶酸储备液，于
‑
20℃冰箱中保存备用，精密称取5
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甲基四氢叶酸钙标品2.260mg，除以校正因子后，用5％NaOH(0.1mol/L)20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mg/mL的5
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甲基四氢叶酸储备液，于
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20℃冰箱中保存备用；内标母液与工作液的配制：精密称取甲氨喋呤标品2.147mg，用5％NaOH(0.1mol/L)20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mg/mL的甲氨喋呤储备液，于
‑
20℃冰箱中保存备用；精密移取上述配制好的甲氨喋呤母液0.02mL，置于1.5mL离心管中，加入0.98mL甲醇：水(1:1；v:v)稀释，混匀，得浓度为10000ng/mL的甲氨喋呤内标溶液1；再次精密移取0.01mL甲氨喋呤内标溶液1，置于1.5mL离心管中，加入0.99mL甲醇：水(1:1；v:v)稀释，混匀，得浓度为100ng/mL的甲氨喋呤内标溶液2；内标工作液即沉淀剂，为甲氨喋呤浓度为2ng/mL的甲醇溶液(0.1mg/mL VC)；
取10μL维生素C储备液，20μL甲氨喋呤内标溶液2(100ng/mL)加入到970μL的甲醇中，即沉淀剂；维生素C溶液的配制：精密称取一定量的维生素C，用超纯水配制成浓度为10mg/mL维生素C储备液，于
‑
20℃冰箱中保存备用，取10μL维生素C储备液，加入到990μL的水中，涡旋得到0.1mg/mL的维生素C工作液；9％氯化钠水溶液的配制：精密称取一定量的氯化钠，用超纯水配制成浓度为0.9％氯化钠水溶液，于4℃冰箱中保存备用；标准曲线工作稀释液和复溶液(10％乙腈水(含0.1mg/mL VC)：取10μL维生素C储备液，100μL纯乙腈，加入到890μL的水中，涡旋得到标准曲线工作稀释液和复溶液；S5.3、质控样品工作溶液的配制分别精密移取配制好的叶酸和5
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甲基四氢叶酸母液0.02mL至1.5mL离心管中，加入0.96mL的10％乙腈水溶液(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释，得浓度为10000ng/mL的混合质控工作液1；HQC工作液：精密移取配制好的，质控工作液1，0.160mL至1.5mL离心管中，加入0.840mL的10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释，得浓度为1600ng/mL的混合质控工作液2，此溶液为高浓度质控工作液；MQC工作液：精密移取配制好的质控工作液2，0.5mL至1.5mL离心管中，加入0.5mL的10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释，得浓度为800ng/mL的混合质控工作液3，此溶液为中浓度质控工作液；精密移取配制好的质控工作液3，0.5mL至1.5mL离心管中，加入0.5mL的10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释，得浓度为400ng/mL的混合质控工作液4；LQC工作液：精密移取配制好的质控工作液4，0.3mL至1.5mL离心管中，加入0.7mL的10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)进行稀释，得浓度为120ng/mL的混合质控工作液5，此溶液为低浓度质控工作液；上述配制好的质控工作液均于
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20℃冰箱中保存备用；S6、标准曲线工作液的配制精密移取上述配制好的叶酸和5
‑
甲基四氢叶酸0.02mL，置于1.5mL离心管中，加入0.960mL标准曲线稀释液稀释，涡旋混匀，得浓度为10000ng/mL的混合工作液1；标准曲线L1点：精密移取0.2mL配制好的工作液1，置于1.5mL离心管中，加入0.8mL10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释，涡旋混匀，得浓度为2000ng/mL的混合工作液2；标准曲线L2点：精密移取0.5mL配制好的工作2，置于1.5mL离心管中，加入0.5mL10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释，涡旋混匀，得浓度为1000ng/mL的混合工作液3；标准曲线L3点：精密移取0.4mL配制好的工作3，置于1.5mL离心管中，加入0.6mL10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释，涡旋混匀，得浓度为400ng/mL的混合工作液4；标准曲线L4点：精密移取0.5mL配制好的工作4，置于1.5mL离心管中，加入0.5mL10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释，涡旋混匀，得浓度为200ng/mL的混合工作液5；
标准曲线L5点：精密移取0.2mL配制好的工作4，置于1.5mL离心管中，加入0.3mL10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释，涡旋混匀，得浓度为160ng/mL的混合工作液6；标准曲线L6点：精密移取0.2mL配制好的工作6，置于1.5mL离心管中，加入0.2mL10％乙腈水(VC浓度为0.1mg/mL)稀释，涡旋混匀，得浓度为80ng/mL的混合工作液7；标准曲线L7点：精密移取0.2mL配制好的工作7，置于1.5mL离心管中，加入0.2mL10％乙腈水(VC...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾继明，王贯宇，陆超瑾，黄文君，周瑶，陆晓春，
申请(专利权)人：苏州和合医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：