一种代谢物组合及应用和检测试剂盒与使用制造技术

本发明专利技术涉及羊水小分子代谢物L

【技术实现步骤摘要】
一种代谢物组合及应用和检测试剂盒与使用


[0001]本专利技术涉及一种用于产前胎儿结构异常辅助诊断的羊水代谢物组合及检测试剂盒，属于检验医学及临床化学、生殖医学领域。

技术介绍

[0002]胎儿结构异常，是指在产前检查中发现的胎儿单器官缺陷或多器官发育异常，是引起新生儿死亡和危重症的主要病因。常见的胎儿结构异常主要包括心脏畸形、中枢神经系统发育异常和泌尿系统发育异常等。其中，胎儿心脏结构异常的发病率在6～19
‰
之间，居于胎儿先天性缺陷的首位，是引起新生儿死亡的最主要疾病原因。常见心脏缺陷主要有心内膜垫缺损、法洛氏四联症、左室流出道梗阻、复杂心脏畸形等。胎儿中枢神经系统发育异常也是常见的先天性畸形之一，中枢神经系统疾病复杂繁多，这其中神经管缺陷最为常见，据文献报道国内发病率为1
‰
～2
‰
。中枢神经系统异常的主要临床指征有前脑无裂畸形、无脑回畸形、胼胝体发育不全或缺失、Dandy
‑
Walker畸形等。泌尿系统畸形在胎儿常见畸形中的发病率也较高，在1.5～4％
‰
之间，常见的合并染色体异常的胎儿泌尿系统异常的临床指征主要有肾积水或肾盂扩张、多囊性肾发育不良、肾囊肿、异位肾等。
[0003]目前，临床上筛查诊断胎儿结构异常的主要手段是超声波检查。同时，因胎儿结构异常与染色体非整倍体、拷贝数变异(CNVs)和发育基因中的致病序列变异等等遗传因素有关。因此，临床上对于超声波检查发现的胎儿结构异常病例或疑似病例，还利用羊水穿刺术等产前诊断手段采集羊水，再利用核型分析和染色体微阵列分析(CMA)等遗传学检测来辅助诊断并明确病因。根据一项权威的医学研究报道，目前约32％结构异常胎儿具有临床相关的异常核型，另外6.5％的胎儿具有致病性CNVs，这也意味着有超过60％的结构异常胎儿没有检测到明确的遗传学缺陷(Wapner RJ, Martin CL,Levy B,et al.Chromosomal microarray versus karyotyping forprenatal diagnosis.N Engl J Med 2012；367:2175
‑
84.)，换言之目前临床上有超过60％以上的结构异常胎儿没有表现出核型分析和CMA检测结果异常。而根据另外一项最新研究报道，对于核型检测和CMA检测均为阴性的胎儿结构异常病例，即使是使用价格高昂且实施周期长的全外显子测序(WES) 也只能在10％的结构异常病例中鉴定出与发育障碍相关的诊断性基因变异 (Slav
é
Petrovski,Vimla Aggarwal,Jessica L Giordano,et al.Whole
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exomesequencing in the evaluation of fetal structural anomalies:a prospective cohort study.Lancet 2019；393(10173):758
‑
767.)。另一方面，超声诊断筛查十分依赖于超声医师的经验与技能，同时还存在一定的漏诊与误诊风险。因此，开发与超声筛查、遗传学检测形成互补的新型诊断技术对于产前胎儿结构异常的辅助诊断，进而对于优生优育都具有重要临床价值。
[0004]羊水起源于母体、胎儿和胎盘组织，羊水中代谢物的浓度是孕期内伴随胎儿成熟而在母体与胎儿体内进行的代谢物合成与降解的最终结果，可以反映胎儿的健康状况，这一生化特性使其成为对胎儿健康诊断极有价值的材料。氨基酸作为蛋白质和核苷酸等大分子生物合成的重要前体，参与胎儿发育和生长。谷氨酰胺和谷氨酸是妊娠晚期胎儿体内最
丰富和使用最多的氨基酸之一。谷氨酸通过高亲和力兴奋性氨基酸转运蛋白转运穿过合体滋养层微绒毛膜和基底膜，并在胎盘中转化为谷氨酰胺，谷氨酸同时也是重要的生物合成氮源和神经递质前体。因此，胎盘
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胎儿中的谷氨酸
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谷氨酰胺循环和交换在胎儿生长发育中发挥着重要作用(Moores RR,Jr.,VaughnPR,Battaglia FC,et al.Glutamate metabolism in fetus and placenta oflate
‑
gestation sheep.Am J Physiol.1994；267(1Pt 2):R89
‑
96.)。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基于两种羊水氨基酸定量检测的新的代谢物组合以及检测试剂盒，应用于产前胎儿结构异常的辅助诊断。所述专利技术的代谢物组合和检测试剂盒的特征如下：
[0006]本专利技术所述的代谢物组合包括两种小分子氨基酸代谢物，即：L
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谷氨酰胺和L
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谷氨酸。
[0007]本专利技术所述的检测试剂盒包括定量液、提取液、稀释液、内标液和微孔板。其中，定量液含有定量外标物L
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谷氨酰胺、L
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谷氨酸和内标物谷氨酰胺
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d5、谷氨酸
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d5，所述外标物分别用于受试者待检羊水中L
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谷氨酰胺、 L
‑
谷氨酸的浓度定量和/或定性鉴定，内标物分别用于L
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谷氨酰胺、L
‑
谷氨酸的定量。提取液是甲醇和/或乙腈溶液，用于受试者待检羊水样本的预处理。稀释液是甲醇和/或乙腈的水溶液(稀释液中添加适量的有机溶剂可以抑制微生物增殖，便于延长有效期)，用于受试者待检羊水提取液的稀释。试剂盒含有3张微孔板，其中一号板是单孔容量750微升的深孔板，用于受试者待检羊水预处理；二号板是单孔容量450微升的浅孔板，用于稀释从一号板中转移出的受试者待检羊水的提取液；三号板同二号板，将二号板中的稀释液转移至三号板，供液相色谱质谱法上机检测。
[0008]本专利技术所述的检测试剂盒的工作流程是：(1)取10～100μL待检羊水样本逐份转移至一号板微孔中，分别加入5～50μL内标液和40～400μL提取液，1500rpm转速涡旋振荡3分钟，将一号板放入离心机，5000rpm转速离心20分钟，得羊水提取液；(2)每份待检样本吸取20～500μL羊水提取液转移至二号板微孔，使用20～500μL稀释液稀释羊水提取液，得羊水稀释液；(3)羊水稀释液5000rpm转速离心20分钟后，每份待检样本吸取30～900μL羊水稀释液转移至三号板微孔中，即可进行液相色谱质谱法上机检测；(4)将所述的定量液、处理后的受试者待检羊水稀释液分别经液相色谱质谱法检测，比较定量液(20～200ng/mL之间任一浓度点)中外标物 L
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谷氨酰胺、L
‑
谷氨酸与受试者待检羊水质谱扫描记录的色谱峰的保留时间，保留时间相差
±
0.05分钟以内，即判断该色谱峰为受试者待检羊水中检测到的两个代谢物的色谱峰，实现对受试者待检羊水中两个氨基酸代谢物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种代谢物组合，为用于产前胎儿结构异常辅助诊断的羊水代谢物组合，包括L
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谷氨酰胺和L
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谷氨酸。2.代谢物组合物在制备用于产前胎儿结构异常辅助诊断的检测试剂盒的应用，或，代谢物组合物在用于产前胎儿结构异常诊断的检测试剂盒的应用，代谢物组合物包括L
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谷氨酰胺和L
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谷氨酸。3.一种用于产前胎儿结构异常辅助诊断的检测试剂盒，所述试剂盒包括：1)定量液：用于建立内标法定量工作曲线，是同时含外标物(在建立内标法定量工作曲线时，不同的外标物分别各自独立地在1～10000ng/mL(优选20～2000ng/mL)区间范围内选择3～15个不同的浓度点)和内标物(在建立内标法定量工作曲线时，不同的内标物分别各自独立地在5～500ng/mL区间范围内选择一个浓度点)的一系列甲醇和/或乙腈的水溶液，溶液中甲醇和/或乙腈的体积比在5～100％之间，其中外标物是L
‑
谷氨酰胺、L
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谷氨酸，所述外标物分别用于受试者待检羊水中L
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谷氨酰胺、L
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谷氨酸的浓度定量和/或定性鉴定；内标物是氘代谷氨酰胺
‑
d5、氘代L
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谷氨酸
‑
d5，浓度分别为5～500ng/mL，所述内标物分别用于受试者待检羊水中L
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谷氨酰胺、L
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谷氨酸的浓度定量；2)提取液：甲醇和/或乙腈溶液(溶液采用的溶剂中甲醇的体积比是0～100％)，用于受试者待检羊水样本的预处理；3)稀释液：甲醇和/或乙腈的水溶液或水溶液(溶液采用的溶剂中甲醇和/或乙腈的体积浓度是0～100％)，用于受试者待检羊水提取液的稀释；4)内标液：含内标物氘代谷氨酰酸
‑
d5、氘代谷氨酸
‑
d5的甲醇和/或乙腈溶液(溶液采用的溶剂中甲醇的体积比是0～100％)，内标物浓度分别为50～20000ng/mL。4.按照权利要求3所述的检测试剂盒，还包括三块微孔板：分别为一、二和三号微孔板，其中一号微孔板是用于受试者待检羊水样本提取的24～96孔微孔板，其中每孔的容量为500～2000μL；二号微孔板是用于稀释受试者待检羊水提取物的24～96孔微孔板，其中每孔的容量为100～1000μL；三号微孔板是用于待检羊水样本稀释液上机检测的24～96孔微孔板，其中每孔的容量为100～1000μL。5.按照权利要求3或4所述的检测试剂盒，使用方法是：1)1份或2份以上的待检羊水样本(若为冷冻的待检羊水样本首先要于室温下解冻)逐份分别转移5～500μL受试者羊水至一号微孔板的1个或2个以上的不同微孔中，每孔中分别加入5～50μL内标液和20～1500μL提取液(为确保后续涡旋时液体不溅洒，优选的体系的总体积需低于或等于单孔容积的70％)，1200～2000rpm、2～5min涡旋振荡后(rpm表示转速单位：转/分钟)，4000～6000rpm、10～60min离心除蛋白，得羊水提取物；2)分别一一转移10～500μL羊水提取物至二号板的1个或2个以上的不同微孔中，每孔加入1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴泽明，尹沛源，
申请(专利权)人：云谱康大连生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：