一种大规模纯化抗PD-1抗体的方法技术

本发明专利技术涉及一种大规模纯化抗PD

【技术实现步骤摘要】
一种大规模纯化抗PD
‑
1抗体的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种大规模纯化抗PD
‑
1抗体的方法。

技术介绍

[0002]抗体药是近几年来迅速发展的一种生物药，随着新药品种在市场份额的不断增加，在癌症和自身免疫疾病等疾病的治疗上发挥着越来越重要的角色。治疗性抗体药物由于对其纯度有极其高要求，才能确保其注射液对患者身体的安全。对于整个生物药行业来说，工业级纯化获得的生物抗体药具有重要的经济效益。抗PD
‑
1抗体作为备受瞩目的一类抗体，目前有多家海内外公司在进行相关的开发，由于该抗体安全性良好，已报道的临床研究结果显示其对某些肿瘤具有显著的抑制作用。
[0003]现有技术中对于抗体的纯化工艺一般涉及多个步骤，常见步骤有亲和层析、低pH病毒孵育、中间深层过滤、阳离子层析、阴离子层析和除病毒过滤等，每个步骤都有其特定的目的和作用，最终得到高纯度的抗体。由于抗体类药物分子的理化性质相似，所以每个公司根据自身条件，将多种纯化步骤串联使用，建立自己的抗体纯化平台，以保障平台工艺的稳定和纯化收率的高效。但是由于大规模放大是多数企业的瓶颈所在，导致生产规模一般维持在50
‑
100L，无法实现更大的经济效益。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种大规模纯化PD
‑
1抗体的方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种大规模纯化抗PD
‑
1抗体的方法，具体包括以下步骤：（1）取含有抗PD
‑
1抗体的细胞上清液，并澄清过滤；（2）将步骤（1）得到的澄清过滤收集液经亲和层析，收集洗脱液；（3）将步骤（2）得到的洗脱液进行低pH病毒孵育；（4）步骤（3）处理后的体系经中间深层过滤得过滤溶液；（5）将步骤（4）得到的过滤溶液经阳离子层析，收集洗脱液；（6）将步骤（5）得到的洗脱液经阴离子层析，收集上样流穿液；（7）将步骤（6）得到的上样流穿液进行除病毒过滤即得纯化后的抗PD
‑
1抗体。
[0006]其中，步骤（2）中，所述的亲和层析，包括平衡、上样、第一淋洗、第二淋洗、第三淋洗、洗脱的操作；其中，第二淋洗缓冲液配方为60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc，0.9
‑
1.1 M NaCl，pH 5.3
‑
5.8；洗脱缓冲液配方为60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc, pH 3.5
‑
3.8；上样载量为18
‑
38 g/L；优选的，第二淋洗缓冲液配方为70 mM NaAc
‑
HAc，1 M NaCl，pH 5.6；洗脱缓冲液配方为70 mM NaAc
‑
HAc, pH 3.7；上样载量为28 g/L。
[0007]其中，步骤（5）中，所述的阳离子层析，包括平衡、上样、淋洗和洗脱的操作；其中，平衡缓冲液和淋洗缓冲液配方为60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc, pH 4.9
‑
5.2；洗脱缓冲液配方为60
‑
pH 5.6，第三淋洗缓冲液为70 mM NaAc
‑
HAc pH 5.5，洗脱缓冲液为70 mM NaAc
‑
HAc, pH 3.7。
[0018]其中，步骤（2）中，所述的亲和层析，其亲和层析柱的装柱方法为：亲和填料首先用注射用水进行三次置换以移除填料原来的保存缓冲液，然后测量匀浆中填料浓度。取出柱头，排空层析柱底部筛网的气泡，混匀容器中的填料，转移所需填料混悬液到层析柱中。待填料沉降到上层溶液澄清后，将柱头放入柱子中开始装柱。设置初始线性流速≤60 cm/h，柱床稳定后，降低柱头，提高流速直至达到柱床目标高度。
[0019]其中，步骤（3）中，所述的低pH病毒孵育具体为：在完成亲和层析后，每个循环的亲和层析洗脱液会单独收集在一次性使用的液体混匀袋中，根据需要添加1 M HAc调整pH值，在15
‑
25℃温度条件下，在pH 3.6
‑
3.8孵育60
‑
240 min进行病毒灭活。灭活结束后，病毒灭活中间产品用1 M Tris
‑
HCl, pH 9.0调节pH至4.9
‑
5.1。
[0020]其中，步骤（4）中，所述的中间深层过滤的主要功能为去除不溶性颗粒和杂质，例如宿主蛋白（HCP）、聚集体、残留Protein A和DNA。
[0021]具体的，亲和收集液经过低pH病毒灭活后，调节pH至4.9
‑
5.1，可发生沉淀。采用深层过滤器过滤去除沉淀后，对中间深层过滤收集液再使用囊式过滤器过滤。
[0022]具体的，上述深层过滤器为Millipore的A1HC深层过滤器、科百特的PurciseSAF滤器L10，囊式过滤器为Millipore 的20英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器，优选的为Millipore的A1HC深层过滤器（货号MA1HC）和Millipore 的20英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器（货号KHGEA）。
[0023]其中，步骤（5）中，所述的阳离子层析，其层析柱采用Life Tech 的POROS XS（货号1
‑
2559）作为层析填料。
[0024]具体的，填料由刚性交联的聚苯乙烯二乙烯苯和荷负电荷的璜丙基配基组成。阳离子交换层析工艺是在中间深层过滤后，进一步纯化蛋白，去除工艺和产品相关杂质及污染物的纯化步骤。
[0025]其中，步骤（5）中，所述的阳离子层析（CEX）是生产工艺中第二个层析步骤。阳离子层析以结合/洗脱的方式在室温下将中间深层过滤的溶液进行阳蛋白纯化。阳离子层析柱首先经使用前1M NaOH消毒，然后用平衡缓冲液60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc, pH 4.9
‑
5.2平衡，准备上样。上样结束后，层析柱首先用淋洗缓冲液60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc, pH 4.9
‑
5.2淋洗，然后再用洗脱缓冲液60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc, pH 6.4
‑
6.7进行洗脱。在产品洗脱完成后，层析柱经再生，使用前消毒和平衡处理后进入下一个循环，直至整个上样样品纯化完成。直到最后一个循环洗脱结束，层析柱经70 mM NaAc
‑
HAc, 1 M NaCl, pH 5.5再生和使用后1M NaOH消毒处理后，最后保存于0.1 M NaOH缓冲液中。AKTA Process使用1 M NaOH消毒后，用0.1 M NaOH保存。阳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大规模纯化抗PD
‑
1抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取含有抗PD
‑
1抗体的细胞上清液，并澄清过滤；（2）将步骤（1）得到的澄清过滤收集液经亲和层析，收集洗脱液；（3）将步骤（2）得到的洗脱液进行低pH病毒孵育；（4）步骤（3）处理后的体系经中间深层过滤得过滤溶液；（5）将步骤（4）得到的过滤溶液经阳离子层析，收集洗脱液；（6）将步骤（5）得到的洗脱液经阴离子层析，收集上样流穿液；（7）将步骤（6）得到的上样流穿液进行除病毒过滤即得纯化后的抗PD
‑
1抗体；步骤（2）中，所述的亲和层析，包括平衡、上样、第一淋洗、第二淋洗、第三淋洗、洗脱的操作；其中，第二淋洗缓冲液为60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc，0.9
‑
1.1 M NaCl，pH 5.3
‑
5.8；洗脱缓冲液为60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc, pH 3.5
‑
3.8；上样载量为18
‑
38 g/L；步骤（5）中，所述的阳离子层析，包括平衡、上样、淋洗和洗脱的操作；其中，平衡缓冲液和淋洗缓冲液为60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc, pH 4.9
‑
5.2；洗脱缓冲液为60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc, pH 6.4
‑
6.7；上样载量为28
‑
52 g/L；步骤（6）中，所述的阴离子层析，包括平衡、上样和淋洗的操作；其中，平衡缓冲液和淋洗缓冲液为60
‑
80 mM NaAc
‑
HAc, pH 5.5
‑
6.1；上样载量为80
‑
135 g/L；其中，所述的大规模为200L以上规模。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的澄清过滤为通过Millipore的D0HC深层过滤器和Millipore的30英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器过滤；澄清过滤后得到的收集液中，抗PD
‑
1抗体的浓度范围为9.0
‑
10.0 g/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的亲和层析为proteinA亲和层析，其层析柱填料采用MabSelect SuRe作为亲和介质。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢伟强，徐传学，李文，王加俊，龙杰，王玉倩，闫少羽，隋东虎，白莉惠，朱吉满，
申请(专利权)人：广州誉衡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：