抗-PD-1抗体及其在制备治疗食管鳞癌患者的药物中的用途制造技术

本发明专利技术涉及抗

【技术实现步骤摘要】
抗
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PD
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1抗体及其在制备治疗食管鳞癌患者的药物中的用途


[0001]本专利技术属于抗体领域，具体的说，涉及一种抗
‑
PD
‑
1抗体及其在制备治疗食管鳞癌患者的药物中的用途。

技术介绍

[0002]所谓的食管鳞癌就是指发生于食道，病理类型为鳞状细胞癌的恶性肿瘤。食道癌属于消化系统常见的恶性肿瘤之一，临床上食道癌最常见的病理类型就是鳞状细胞癌，它占到了食道癌90％的比例。除此之外，食道癌还包括的病理类型有腺癌、小细胞未分化癌和癌肉瘤。目前临床上食道鳞癌最常见的临床症状是进行性加重的吞咽困难，并且随着病情的进展，患者还会出现转移灶的相关临床症状。
[0003]目前临床上对于食道鳞癌的治疗，早期病例还是采取根治性手术切除或根治性的放射治疗。对于上中段的食道鳞癌患者，一般采取根治性的放射治疗。对于下段的早期食道鳞癌患者，则采取根治性的手术治疗，对于中晚期的食道鳞癌患者，采取化疗、放射治疗为主的综合治疗。
[0004]虽然近年来对食管鳞癌的前期诊断、手术治疗、化疗药物的研究开发获得了一定的研究成果，但是食管鳞癌的死亡率和5年内的复发率仍然居高不下，也在另一方面证明了开发新的药物治疗和治疗策略的必要性。

技术实现思路

[0005]为了克服
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供了一种抗
‑
PD
‑
1抗体及其在制备治疗食管鳞癌患者的药物中的用途。
[0006]为实现上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：
[0007]抗
‑
PD
‑
1抗体或其抗原结合片段在制备治疗食管鳞癌患者的药物中的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
[0008]重链可变区，其包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；和轻链可变区，其包括SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
[0009]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其是全人源单克隆抗体。
[0010]进一步的，所述抗体或其抗原结合片段，其中所述全人源单克隆抗体由转基因大鼠生产。
[0011]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其阻断人PD
‑
1与其配体结合，并且因此提供以下活性中的至少一个：
[0012]a)在CD4
+ T细胞中诱导IL
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2的产生；
[0013]b)在CD4
+ T细胞中诱导IFNγ的产生；
[0014]c)诱导CD4
+ T细胞的增殖；以及
[0015]d)逆转Treg抑制功能。
[0016]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其是双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、dsFv、(dsFv)2、dsFv
‑
dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'或F(ab')2。
[0017]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，所述双功能抗体是BsFv或ds双功能抗体(ds diabody)。
[0018]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括免疫球蛋白恒定区。
[0019]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括缀合物。
[0020]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种抗PD
‑
1抗体，为食管鳞癌的治疗提供了一种新的途径。
具体实施方式
[0021]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本专利技术的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
[0022]实施例1：抗体杂交瘤的生成
[0023]1.1免疫原的生成
[0024]合成编码PD
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1和PD
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L1的ECD的或二者全长的DNA并插入表达载体pcDNA3.3。大量制备质粒DNA并经测序验证插入的DNA序列。PD
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1ECD和PD
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L1ECD的融合蛋白包含多种标记，包括人源Fc、小鼠Fc和His标记，所述融合蛋白通过将人PD
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1ECD基因转染进入CHO
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S或HEK293细胞制备。5天后，将从所述瞬时转染的细胞培养中收获的上清液用于蛋白纯化。将所述融合蛋白纯化并定量以用于免疫和筛选。
[0025]1.2建立稳定细胞系
[0026]为了获得用于抗体筛选和验证的工具，建立了PD
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1和PD
‑
L1转染细胞系。简言之，根据厂商说明书使用Lipofectamine 2000转染试剂盒将含有全长PD
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1或PD
‑
L1的pCND3.3表达载体转染CHO
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K1、293F或Ba/F3细胞。转染后48
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72小时，在含有用于选择的杀稻瘟菌素(Blasticidin)或G418的培养基中培养所述转染细胞。一段时间后，会选择出在基因组DNA中稳定掺入了PD
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1或PD
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L1基因的细胞。同时，验证所述细胞是否具有目的基因PD
‑
1和PD
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L1的表达。一旦验证了所述表达，通过有限的稀释挑选目的单个克隆并放大到大容量。随后将建立的单克隆细胞系在含有低剂量抗生素杀稻瘟菌素(Blasticidin)或G418的培养基中维持。
[0027]1.3抗体杂交瘤的建立
[0028]1.3.1免疫和细胞融合：使用8
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1 0周龄OMT
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大鼠(获自Open Monoclonal Technology,Inc.,Palo Alto,US)用10μg TiterMax中的人源PD
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1ECD蛋白在足垫上进行初次激发免疫，每3天用铝剂配置的PD
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1ECD重复进行免疫。每2周对大鼠取血收集血清并通过ELISA或FACS测试测定抗体滴度。当所述抗体滴度达到足够高时，对大鼠给予最后的不含佐剂的激发(加入100μl 1XPBS替代)，按如下步骤进行细胞融合：将从免疫的OMT
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大鼠的淋巴结中分离的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合(以1:1比例)。用5
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10ml ECF溶液洗涤并悬浮细胞混合物。加入ECF溶液将浓度调整至2x106细胞/ml。在细胞电融合后，将融合室中的细胞悬液立即转移进入含有更多体积培养基的无菌管中。在37℃培养超过24小时后，将所述细胞悬液混合并移液入96孔板(0.5x106细胞/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。当所述克隆足够大时，将100μl上清液从96孔板转移用于抗体筛选测试。
[0029]1.3.2杂交瘤上清液的第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗
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PD
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1抗体或其抗原结合片段在制备治疗食管鳞癌患者的药物中的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区，其包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；和轻链可变区，其包括SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。2.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，其是全人源单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的用途，所述抗体或其抗原结合片段，其中所述全人源单克隆抗体由转基因大鼠生产。4.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，其阻断人PD
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1与其配体结合，并且因此提供以下活性中的至少一个：a...

【专利技术属性】
技术研发人员：白莉惠，朱吉满，
申请(专利权)人：广州誉衡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：