抗-PD-1抗体及其在制备治疗鼻咽癌患者的药物中的用途制造技术

本发明专利技术涉及抗

【技术实现步骤摘要】
抗
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PD
‑
1抗体及其在制备治疗鼻咽癌患者的药物中的用途


[0001]本专利技术属于抗体领域，具体的说，涉及一种抗
‑
PD
‑
1抗体及其在制备治疗鼻咽癌患者的药物中的用途。

技术介绍

[0002]鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤。是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。常见临床症状为鼻塞、涕中带血、耳闷堵感、听力下降、复视及头痛等。鼻咽癌大多对放射治疗具有中度敏感性，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法。但是对较高分化癌，病程较晚以及放疗后复发的病例，手术切除和化学药物治疗亦属于不可缺少的手段。
[0003]鼻咽癌大多对放射治疗具有中度敏感性，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法。但是对较高分化癌，病程较晚以及放疗后复发的病例，手术切除和化学药物治疗亦属于不可缺少的手段。
[0004]虽然近年来对鼻咽癌的前期诊断、手术治疗、化疗药物的研究开发获得了一定的研究成果，但是鼻咽癌的死亡率和5年内的复发率仍然居高不下，也在另一方面证明了开发新的药物治疗和治疗策略的必要性。

技术实现思路

[0005]为了克服
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供了一种抗
‑
PD
‑
1抗体及其在制备治疗鼻咽癌患者的药物中的用途。
[0006]为实现上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：
[0007]抗
‑
PD
‑
1抗体或其抗原结合片段在制备治疗鼻咽癌患者的药物中的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
[0008]重链可变区，其包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；和轻链可变区，其包括SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
[0009]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其是全人源单克隆抗体。
[0010]进一步的，所述抗体或其抗原结合片段，其中所述全人源单克隆抗体由转基因大鼠生产。
[0011]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其阻断人PD
‑
1与其配体结合，并且因此提供以下活性中的至少一个：
[0012]a)在CD4+ T细胞中诱导IL
‑
2的产生；
[0013]b)在CD4+ T细胞中诱导IFNγ的产生；
[0014]c)诱导CD4+ T细胞的增殖；以及
[0015]d)逆转T
‑
reg抑制功能。
[0016]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其是双功能抗体(diabody)、scFv、scFv
二聚体、dsFv、(dsFv)2、dsFv
‑
dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'或F(ab')2。
[0017]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，所述双功能抗体是BsFv或ds双功能抗体(ds diabody)。
[0018]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括免疫球蛋白恒定区。
[0019]进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括缀合物。
[0020]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种抗PD
‑
1抗体，为鼻咽癌的治疗提供了一种新的途径。
具体实施方式
[0021]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本专利技术的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
[0022]实施例1：抗体杂交瘤的生成
[0023]1.1免疫原的生成
[0024]合成编码PD
‑
1和PD
‑
L1的ECD的或二者全长的DNA并插入表达载体pcDNA3.3。大量制备质粒DNA并经测序验证插入的DNA序列。PD
‑
1ECD和PD
‑
L1ECD的融合蛋白包含多种标记，包括人源Fc、小鼠Fc和His标记，所述融合蛋白通过将人PD
‑
1ECD基因转染进入CHO
‑
S或HEK293细胞制备。5天后，将从所述瞬时转染的细胞培养中收获的上清液用于蛋白纯化。将所述融合蛋白纯化并定量以用于免疫和筛选。
[0025]1.2建立稳定细胞系
[0026]为了获得用于抗体筛选和验证的工具，建立了PD
‑
1和PD
‑
L1转染细胞系。简言之，根据厂商说明书使用Lipofectamine 2000转染试剂盒将含有全长PD
‑
1或PD
‑
L1的pCND3.3表达载体转染CHO
‑
K1、293F或Ba/F3细胞。转染后48
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72小时，在含有用于选择的杀稻瘟菌素(Blasticidin)或G418的培养基中培养所述转染细胞。一段时间后，会选择出在基因组DNA中稳定掺入了PD
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1或PD
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L1基因的细胞。同时，验证所述细胞是否具有目的基因PD
‑
1和PD
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L1的表达。一旦验证了所述表达，通过有限的稀释挑选目的单个克隆并放大到大容量。随后将建立的单克隆细胞系在含有低剂量抗生素杀稻瘟菌素(Blasticidin)或G418的培养基中维持。
[0027]1.3抗体杂交瘤的建立
[0028]1.3.1免疫和细胞融合：使用8
‑
1 0周龄O M T
‑
大鼠(获自Open Monoclonal Technology,Inc.,Palo Alto,US)用10μg TiterMax中的人源PD
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1ECD蛋白在足垫上进行初次激发免疫，每3天用铝剂配置的PD
‑
1ECD重复进行免疫。每2周对大鼠取血收集血清并通过ELISA或FACS测试测定抗体滴度。当所述抗体滴度达到足够高时，对大鼠给予最后的不含佐剂的激发(加入100μl 1XPBS替代)，按如下步骤进行细胞融合：将从免疫的OMT
‑
大鼠的淋巴
‑
结中分离的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合(以1:1比例)。用5
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10ml ECF溶液洗涤并悬浮细胞混合物。加入ECF溶液将浓度调整至2x106细胞/ml。在细胞电融合后，将融合室中
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的细胞悬液立即转移进入含有更多体积培养基的无菌管中。在37℃培养超过24小时后，将
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所述细胞悬液混合并移液入96孔板(0
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.5x106细胞/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。当
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所述克隆足够大时，将100μl上清液从96孔板转移用于抗体筛选测试。
[0029]1.3.2杂交瘤上清液的第一轮和确认本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗
‑
PD
‑
1抗体或其抗原结合片段在制备治疗鼻咽癌患者的药物中的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区，其包括SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；和轻链可变区，其包括SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。2.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，其是全人源单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的用途，所述抗体或其抗原结合片段，其中所述全人源单克隆抗体由转基因大鼠生产。4.根据权利要求1所述用途，所述的抗体或其抗原结合片段，其阻断人PD
‑
1与其配体结合，并且因此提供以下...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱吉满，白莉惠，
申请(专利权)人：广州誉衡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：