本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体涉及一种检测PRCC/TFE3基因的荧光原位杂交探针组及其制备方法和应用。本发明专利技术通过在PRCC和TFE3基因的目标区域，构建与目标区域完全互补的长度为45bp的单链片段作为候选探针，然后将每一条序列进行批量BLAST比对，保证杂交的每一条探针序列的高特异性；同时精确控制目标区域的靶向，获得说明书表1中所示的1533个核苷酸序列，再在每个核苷酸序列的两端添加标签序列得到特征性引物，以特征性引物为模板，PCR扩增、纯化后得到探针组。采用上述探针组用于检测PRCC/TFE3基因融合状态，成本较低且在30分钟左右即可完成骨髓样本的FISH杂交，敏感性高，特异性强且杂交背景干净、信噪比低。信噪比低。
【技术实现步骤摘要】
检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组及其制备方法和应用
[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种检测PRCC/TFE3基因的荧光原位杂交探针组及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]Xp11.2易位性肾细胞癌(tRCC)是一种罕见的肾细胞癌(RCC)亚型，是TFE3转录因子基因融合的结果，在世界卫生组织(WHO)泌尿系统肿瘤分类中被纳入MiT家族tRCC。在肾癌中，Xp11.2 tRCC占儿童肾肿瘤的20％至75％，约占成人肾细胞癌的1.5％。Xp11.2 tRCC中最常见的基因融合是Xp11.2上的TFE3基因与1q21位点的PRCC基因发生融合，TFE3基因与17q25位点的ASPL基因发生融合，这些基因融合来自于t(X；1)(p11.2；q12)和t(X；17)(p11.2；q25.3)易位，其他发生较少的TFE3融合伙伴包括SFPQ、Nono、CLTC和RBM10，它们由t(X；1)(p11.2；p34)，inv(X)(p11.2q12)，t(X；17)(p11.2；q23)和inv(X)(p11.2p11.23)引起，一些融合伙伴，如PARP14,KHTFESRP,LUC7L3和DVL2，仅在个别患者中被发现。
[0003]荧光原位杂交实验可以用于评估PRCC/TFE3基因融合状态。传统的商业化FISH探针主要使用BAC克隆作为探针，经过荧光分子标记后进行杂交检测，然而，BAC克隆制备的探针存在一些非重复序列，探针特异性不高，需要使用Cot1
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DNA进行非封闭性封闭，且BAC克隆制备的探针片段普遍偏大，长度在200～500bp之间，杂交效率偏低，杂交时间长。
技术实现思路
[0004]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组，该探针组由说明书表1中所示的1533个核苷酸序列制备得到。
[0005]作为一种优选的实施方式，该探针组由上述的核苷酸序列通过添加标签序列后扩增得到。
[0006]作为一种优选的实施方式，所述核苷酸序列的5
’
端标签序列为：TAATACGACTCACTATAGGG；3
’
端标签序列为：CCGCTGAGCAATAACTAGCA。
[0007]作为一种优选的实施方式，PCR扩增体系中含有Alexa fluor555
‑
dUTP和Alexa fluor488
‑
dUTP。
[0008]本专利技术还提供了上述探针组的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1，以PRCC和TFE3基因序列为依据，在不含重复序列的区域分别设计含45个碱基核苷酸序列，设定探针Tm为50℃，GC含量范围为40～60％，舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序列后，得到2001条候选探针，再经过全基因hg38 BLAST比对分析后，最终得到1533个核苷酸序列，具体参见说明书表1所示；
[0010]S2，分别在每条核苷酸序列的5
’
端加上20bp的标签序列、3
’
端加上20bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的特征性引物，其中5
’
端标签序列为：TAATACGACTCACTATAGGG，3
’
端标签序列为：CCGCTGAGCAATAACTAGCA；
fluor488
‑
dUTP标记的dUTP进行PCR扩增，将荧光标记材料掺入PCR产物中，得到荧光标记的PCR产物；PCR扩增时的引物为：Primer
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F:TAATACGACTCACTATAGG，Primer
‑
R:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG；
[0027]PCR扩增体系为：10x buffer 5μL、F+R primer(10uM)2μL、洗脱后特征性引物1μL、10mM dATP 1μL、10mM dCTP 1μL、10mM dGTP 1μL、10mM dTTP 0.75μL、1mM Alexa fluor555
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dUTP 2.5μL、Taq DNA polymerase 0.5μL、ddH20 35.25μL；
[0028]PCR反应程序为94℃5min、55℃5min；72℃2min、94℃1min、55℃1min，30个循环；72℃5min、4℃保温。
[0029]S4，对步骤S3扩增后的PCR产物进行纯化，得到荧光原位杂交探针组。
[0030]表1 1533条探针的序列信息
[0031][0032][0033][0034][0035][0036][0037][0038][0039][0040][0041][0042][0043]将上述制备得到的探针组按照下表2的组分混合制备得到杂交缓冲液，并进一步制备成试剂盒。
[0044]表2 10人份的杂交缓冲液的制备
[0045]成分10人份终浓度实施例1的探针组合10μL20ng/μL(各探针)去离子甲酰胺45μL45％50％葡聚糖20μL10％20
×
SSC10μL2
×
SSC(0.2M)Tris
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HCl(pH8.0～8.8)5μL50mM水10μL
‑
[0046]实施例2正常人外周淋巴细胞滴片实验
[0047]材料：人外周血淋巴细胞培养基、秋水仙碱、低渗液(质量体积百分比为0.4％的KCl)、固定液(甲醇:乙酸＝3:1，体积比)。
[0048]S1，细胞培养及同步化：取0.4mL肝素抗凝全血于人外周血淋巴细胞培养基中，混匀后于37℃、5％CO2恒温培养箱内培养72h，并于终止前4h，向培养基中加入秋水仙素至终浓度(0.1μg/mL)继续培养4h；
[0049]S2，收集和固定：收集培养基，500g离心5min后，弃上清，再加入0.4％KCl低渗液孵育30min，然后用甲醇
‑
冰醋酸固定液固定细胞，室温静置10min，500g离心沉淀细胞，重复细胞固定步骤一遍，弃上清液后，根据细胞数量加入适当固定液悬浮细胞；
[0050]S3，制片：吸取7
‑
10μL细胞悬液，自70
‑
80cm高处滴在一张干燥清洁的载玻片上，吹干后，56℃烤片2h；
[0051]S4，变性杂交：取10μL实施例1中制得的杂交缓冲液滴加到处理好的样本的玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边，避免盖玻片与玻片之间产生气泡，杂交仪上95℃共变性2min，42℃杂交30min；
[0052]S5，杂交后洗涤：用镊子小心撕去盖玻片周围封片胶，避免粘掉或者移动盖玻片；将载玻片放入稀释后的洗涤液1(含0.6M氯化钠和50mM Tris
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Hcl)中浸泡1min，待盖玻片自然脱落，再将载玻片放入洗涤液2(含0.6M氯化本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组，其特征在于，该探针组由说明书表1中所示的1533个核苷酸序列制备得到。2.根据权利要求1所述的检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组，其特征在于，该探针组由权利要求1所述的核苷酸序列通过添加标签序列后扩增得到。3.根据权利要求2所述的检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组，其特征在于，所述核苷酸序列的5
’
端标签序列为：TAATACGACTC ACTATAGGG；3
’
端标签序列为：CCGCTGAGCAATAACTAGCA。4.根据权利要求2或3所述的检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组，其特征在于，PCR扩增体系中含有Alexa fluor555
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dUTP和Alexa fluor488
‑
dUTP。5.根据权利要求1～4任一项所述的检测PRCC/TFE3融合基因的荧光原位杂交探针组的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，以PRCC和TFE3基因序列为依据，在不含重复序列的区域分别设计含45个碱基核苷酸序列，设定探针Tm为50℃，GC含量范围为40～60％，舍弃包含AAAA/TTTT/CCCC/GGGG的序列后，得到2001条候选探针，再经过全基因hg38 BLAST比对分析后，最终得到1533个核苷酸序列，具体参见说明书表1所示；S2，分别在每条核苷酸序列的5
’
端加上20bp的标签序列、3
’
【专利技术属性】
技术研发人员：祝丹平，魏亮，董祥，詹悦，喻晓雯，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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