基于外泌体miRNA-206表达水平的胃癌恶液质早期诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于外泌体miRNA

【技术实现步骤摘要】
Dicer进一步加工得到成熟双链RNA分子，其中一条成熟链插入RNA诱导沉默复合物(RISC)，与其靶基因mRNA的3`端非翻译区(3`UTR)结合，裂解其靶基因mRNA或抑制蛋白质表达，从而发挥其生物学特性，调控细胞的增殖、分化、凋亡和迁移等多种生物学行为。Hsa
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206可以抑制多个靶基因的表达；同一个靶基因也可以受到多个miRNA的调控。由此形成的分子调控网络在胚胎发育、正常生理功能以及多种疾病的病理过程中发挥作用。据报道，Hsa
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206在多种肿瘤中发挥重要作用。Hsa
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206也被报道与肺、脑、心脏等疾病的发生有密切联系。Takada等研究发现，Hsa
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206的表达水平在胚胎发育中稳步上升，在出生后趋于下降。Hsa
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206与靶基因Pax7、Pax3等的关系，对骨骼肌的发育起到了至关重要的作用。Hsa
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206同样也可以通过抑制脑源性神经营养因子的表达，调节突触可塑性和记忆。
[0006]Yan等证实，Hsa
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206通过调控靶基因Met，进而抑制RMS的生长和转移。包括乳腺癌、横纹肌肉瘤、卵巢癌、结直肠癌、肺癌等在内，Hsa
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206均显著下调，在肿瘤的生长过程中发挥重要作用。目前尚未见到通过对外周血中血浆外泌体内含的miRNA的检测进行胃癌恶液质预测，从而实现胃癌恶液质的便捷、准确的早期诊断的试剂盒。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种基于外泌体miRNA
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206表达水平的胃癌恶液质早期诊断试剂盒，该试剂盒可以通过对血浆外泌体中的Hsa
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206的实时定量PCR检测，提高对胃癌恶液质早期诊断的准确性，改善胃癌患者的预后状况。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0009]一种检测血浆中外泌体miRNA
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206含量的方法，包括以下步骤：
[0010]1)提取胃癌患者血浆中的外泌体RNA，将所述外泌体RNA中的miRNA反转录，得到外泌体miRNA的反转录本；
[0011]2)以所述外泌体miRNA的反转录本(该反转录本是将提取自血浆外泌体的总RNA中的miRNA进行反转录而得到的cDNA)为模板，通过实时定量PCR扩增血浆外泌体中的Hsa
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206(即外泌体miRNA
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206)对应的cDNA序列，扩增结束后确定血浆外泌体中的Hsa
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206对应的cDNA序列的扩增循环阈值Ct(简称Hsa
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206的扩增循环阈值Ct)；
[0012]3)计算所述Hsa
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206的扩增循环阈值Ct与内参基因的扩增循环阈值Ct的差值ΔCT。
[0013]优选的，所述步骤1)中，对采集的胃癌患者(通过组织或细胞病理诊断确诊胃癌)外周血进行离心，得到血浆，从该血浆中抽提得到外泌体RNA。
[0014]优选的，所述步骤2)中，血浆外泌体中的Hsa
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206对应的cDNA序列的实时定量PCR扩增引物由上游引物和下游引物组成，其中，下游引物为miRNA通用引物，上游引物的序列为：
[0015]5`
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TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG
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3`。
[0016]一种胃癌恶液质早期诊断试剂盒，该试剂盒包括Hsa
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206的实时定量PCR扩增引物(例如，上述上游引物和下游引物)。
[0017]优选的，上述Hsa
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miR
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206提取自胃癌患者外周血。
[0018]优选的，上述Hsa
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206提取自胃癌患者的血浆外泌体。
[0019]优选的，当胃癌患者(例如，未确诊恶液质的胃癌患者)血浆外泌体中的Hsa
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206的扩增循环阈值Ct与内参基因的扩增循环阈值Ct的差值ΔCT超出限值时(例如，Hsa
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206的扩增循环阈值与内参基因U6的扩增循环阈值的差值ΔCT满足：2<ΔCT≤4时)，该差值ΔCT越接近限值(例如，2)则表明该患者患恶液质的风险越高。
[0020]上述Hsa
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206在制备胃癌恶液质早期诊断试剂盒中的应用。
[0021]上述Hsa
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206的反转录本在制备胃癌恶液质早期诊断试剂盒中的应用。
[0022]上述Hsa
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206的扩增引物在制备胃癌恶液质早期诊断试剂盒中的应用。
[0023]本专利技术的有益效果体现在：
[0024]本专利技术依据高通量测序所筛选出的与胃癌恶液质密切相关的miRNA开发诊断试剂盒，可以通过检测胃癌患者血浆外泌体中的特定miRNA的表达，预测胃癌患者恶液质的发生，且不易受其他基础疾病影响，从而为胃癌患者临床用药、营养支持提供更为准确、可靠的参考标准。本专利技术的诊断试剂盒可以基于外泌体RNA提取及miRNA检测等成熟技术而开发，只需要采集少量血液，适用于大多数胃癌患者，并且可快速、方便的获得诊断结果。
[0025]进一步的，本专利技术通过对实时定量PCR扩增引物的序列设计，可以对胃癌患者血浆外泌体中的Hsa
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206的表达进行快速、准确、可靠的检测。
附图说明
[0026]图1A为所提取外泌体的电镜(TEM)鉴定。
[0027]图1B为所提取外泌体的纳米颗粒跟踪分析(NTA)。
[0028]图1C为所提取外泌体的Western Blotting鉴定。
[0029]图2A为3例胃癌恶液质患者和2例胃癌非恶液质患者的血浆外泌体的高通量测序分析结果(差异表达miRNA火山图)。
[0030]图2B为3例胃癌恶液质患者和2例胃癌非恶液质患者的血浆外泌体的高通量测序分析结果(差异表达miRNA聚类图)。
[0031]图3为筛选出的Hsa
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206在胃癌患者血浆外泌体中的表达情况；其中：Normal代表胃癌非恶液质组；Cachexia代表胃癌恶液质组；***P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中外泌体miRNA
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206含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)提取胃癌患者血浆中的外泌体RNA，将所述外泌体RNA中的miRNA反转录，得到外泌体miRNA的反转录本；2)以所述外泌体miRNA的反转录本为模板，通过实时定量PCR扩增血浆外泌体中的Hsa
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206，并确定血浆外泌体中的Hsa
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206的扩增循环阈值；3)计算所述Hsa
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206的扩增循环阈值与内参基因的扩增循环阈值的差值ΔCT。2.根据权利要求1所述一种检测血浆中外泌体miRNA
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206含量的方法，其特征在于：所述步骤2)中，血浆外泌体中的Hsa
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206的实时定量PCR扩增引物由上游引物和下游引物组成，其中，下游引物为miRNA通用引物，上游引物的序列为：5`
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TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG
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3`。3.一种胃癌恶液质早期诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括Hsa
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206的实时定量PCR扩增引物。4.根据权利要求3所述一种胃癌恶液质早期诊断试剂盒，其特征在于：所述Hsa
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【专利技术属性】
技术研发人员：李纪鹏，张瑞，姜勋亮，王珂，刘俊，丁晓琛，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：