基于外泌体miRNA-4433-5p表达水平的胃癌恶液质早期诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于外泌体miRNA

【技术实现步骤摘要】
基于外泌体miRNA
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5p表达水平的胃癌恶液质早期诊断试剂盒


[0001]本专利技术属于肿瘤医学领域，涉及检测血浆外泌体中Hsa
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miR
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5p的含量，以及用于根据外泌体miRNA
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5p表达情况对胃癌恶液质进行早期诊断的试剂盒。

技术介绍

[0002]胃癌(Gastric cancer，GC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，具有高发病率、高死亡率的特点，发病率和死亡率逐年上升。尽管随着医疗技术的不断发展，癌症的治疗手段正在不断被人们所研究，但是由于胃癌发病率高，且具有早期不易诊断的特点，提高胃癌患者的生存率依然面临巨大挑战。恶液质是一种多因素代谢综合症，恶液质患者临床主要表现为体重减轻和肌肉萎缩(伴随或不伴随脂肪丢失)，肿瘤引起的恶液质最为常见，称肿瘤恶液质(Cancer cachexia)。研究表明，超过20％的肿瘤恶液质患者直接死于恶液质，恶液质在胃肠道肿瘤中尤为常见，80％的胃癌患者都会出现恶液质。肿瘤患者发生恶液质后对化疗药毒性更敏感，生活质量也降低，因此严重影响肿瘤患者的预后。目前尚缺乏诊断和治疗恶液质的有效手段，许多研究都集中在预测肿瘤恶液质发生的生物标记物方面。但一般血清标志物的检测对恶液质的预测价值不高，例如CEA、CA19
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9、CA724等肿瘤标志物，仅能预测发生肿瘤的可能性，而不能预测恶液质的发生。
[0003]外泌体的功能之一是作为细胞间通讯的介质，与肿瘤的增殖、凋亡、耐药和转移息息相关。而作为主要的活性物质之一的非编码RNA，是外泌体发挥以上功能的生物学基础。非编码RNA主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non
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coding RNA，lncRNA)，以及环状RNA(ciRNA)等。其中，miRNA是一类长度为19～25nt的内源单链RNA，其通过转录后基因沉默机制对下游靶mRNA发挥精细调节作用，影响细胞的恶性转化、非锚定依赖性生长、上皮间质转化、血管生成、药物耐受等诸多肿瘤恶性表型。外泌体能够携带miRNA进入循环系统，通过自分泌、旁分泌和内旁分泌的方式将其囊泡结构中所含miRNA(即外泌体miRNA)运送至特异的靶细胞，使外泌体中的miRNA不仅能够逃避降解，而且促进了细胞与细胞之间、组织与组织之间的联系。
[0004]随着miRNA的发现，众多miRNA被证实参与炎症反应、诱导转移以及介导癌症侵袭，甚至参与骨骼肌中蛋白质的合成和降解通路。肿瘤的发生能触发肿瘤细胞与肌肉细胞的交流，引起肌肉中蛋白质的降解和代谢。肿瘤发展过程中miRNA表达谱的变化能影响肌肉相关的疾病的发生。改变miRNA的含量能够影响肌生成，导致骨骼肌肥大或萎缩，进而导致恶液质的发生，其机制可能是通过诱导肌细胞内凋亡相关信号通路或泛素蛋白酶系统激活，从而促进肌细肉中蛋白质降解。
[0005]Hsa
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5p是一种较为罕见的miRNA，其在以往的研究中鲜有报道。2019年一篇发表在Journal of Cancer上的文章首次报道了其与慢性粒细胞性白血病的关系，文章中Hsa
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5p被鉴定为靶向Bcr
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Abl的miRNA，可能受到SAHA的表观遗传调控，SAHA是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，其已被美国FDA批注用于治疗皮肤性T细胞淋巴瘤。文章
认为，Hsa
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5p的稳定表达可以抑制Bcr
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Abl及下游基因的表达，从而抑制癌细胞的活性。而Hsa
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5p在其他肿瘤中的功能与作用未见报道。
[0006]目前尚未见到通过对外周血中血浆外泌体内含的miRNA的检测进行胃癌恶液质预测，从而实现胃癌恶液质的便捷、准确的早期诊断的试剂盒。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种基于外泌体miRNA
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5p表达水平的胃癌恶液质早期诊断试剂盒，该试剂盒可以通过对血浆外泌体中Hsa
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5p的实时定量PCR检测，提高对胃癌恶液质早期诊断的准确性，改善胃癌患者的预后状况。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0009]一种检测血浆中外泌体miRNA
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5p含量的方法，包括以下步骤：
[0010]1)提取胃癌患者血浆中的外泌体RNA，将所述外泌体RNA中的miRNA反转录，得到外泌体miRNA的反转录本；
[0011]2)以所述外泌体miRNA的反转录本(该反转录本是将提取自血浆外泌体的总RNA中的miRNA进行反转录而得到的cDNA)为模板，通过实时定量PCR扩增血浆外泌体中的Hsa
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5p(即外泌体miRNA
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5p)对应的cDNA序列，扩增结束后确定血浆外泌体中的Hsa
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5p对应的cDNA序列的扩增循环阈值Ct(简称Hsa
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5p的扩增循环阈值Ct)；
[0012]3)计算所述Hsa
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5p的扩增循环阈值Ct与内参基因的扩增循环阈值Ct的差值ΔCT。
[0013]优选的，所述步骤1)中，对采集的胃癌患者(通过组织或细胞病理诊断确诊胃癌)外周血进行离心，得到血浆，从该血浆中抽提得到外泌体RNA。
[0014]优选的，所述步骤2)中，血浆外泌体中的Hsa
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5p对应的cDNA序列的实时定量PCR扩增引物由上游引物和下游引物组成，其中，下游引物为miRNA通用引物，上游引物的序列为：
[0015]5`
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ATGTCCCACCCCCACTCCTGT
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3`。
[0016]一种胃癌恶液质早期诊断试剂盒，该试剂盒包括Hsa
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5p的实时定量PCR扩增引物(例如，上述上游引物和下游引物)。
[0017]优选的，上述Hsa
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中外泌体miRNA
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5p含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)提取胃癌患者血浆中的外泌体RNA，将所述外泌体RNA中的miRNA反转录，得到外泌体miRNA的反转录本；2)以所述外泌体miRNA的反转录本为模板，通过实时定量PCR扩增血浆外泌体中的Hsa
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5p，并确定血浆外泌体中的Hsa
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5p的扩增循环阈值；3)计算所述Hsa
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5p的扩增循环阈值与内参基因的扩增循环阈值的差值ΔCT。2.根据权利要求1所述一种检测血浆中外泌体miRNA
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5p含量的方法，其特征在于：所述步骤2)中，血浆外泌体中的Hsa
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5p的实时定量PCR扩增引物由上游引物和下游引物组成，其中，下游引物为miRNA通用引物，上游引物的序列为：5`
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ATGTCCCACCCCCACTCCTGT
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3`。3.一种胃癌恶液质早期诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括Hsa
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5p的实时定量PCR扩增引物对。4.根据权利要求3所述一种胃癌恶液质早期诊断试剂盒，其特征在于：所述Hsa
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【专利技术属性】
技术研发人员：李纪鹏，张瑞，姜勋亮，王珂，刘俊，丁晓琛，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：