【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因表达调控的安全开关
[0001]交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求提交于2020年1月17日的美国临时申请号62/962,730、提交于2020年1月17日的美国临时申请号62/962,739和提交于2020年1月17日的美国临时申请号62/962,764的优先权，这些美国临时申请的公开内容以引用方式整体并入本文。
[0003]序列表以引用方式并入
[0004]本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表以名为SANA006WO1SeqList.txt的文档形式提供，该文档创建于2021年1月14日，大小为33,948字节。电子格式的序列表中的信息以引用方式整体并入。
技术介绍
[0005]退行性疾病对人健康构成极大的威胁。这些疾病通常与年龄相关，会导致受影响的组织和器官逐渐恶化，最终导致受影响的受试者残疾和死亡。再生医学的前景是用新的健康细胞代替患病或缺失细胞。在过去的五年中，出现了一种新的再生医学范式—使用人多能干细胞(hPSC)来生成任何成体细胞类型以移植到患者体内。原则上，基于hPSC的细胞疗法具有治疗大多数(如果不是全部)退行性疾病的潜力，但是此类疗法的成功可能会受到受试者免疫反应的限制。
[0006]已被认为可以克服免疫排斥的策略包括HLA匹配(例如，同卵双胞胎或脐带库)、向受试者施用免疫抑制药物、阻断抗体、骨髓抑制/混合嵌合、HLA匹配的干细胞库和自体干细胞疗法。
[0007]仍然需要用于克服与细胞疗法相关的免疫排斥的新途径、组
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于控制工程化细胞的免疫原性的方法，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)向所述分离的细胞中引入(i)包含可操作地连接到靶向免疫抑制因子的shRNA序列的诱导型RNA聚合酶启动子的核酸和(ii)包含可操作地连接到对应于所述诱导型RNA聚合酶启动子的反式激活因子元件的启动子的核酸，以产生工程化细胞；以及(c)将所述工程化细胞暴露于外源因子以激活所述反式激活因子元件，从而控制所述工程化细胞的所述免疫原性。2.一种用于控制工程化细胞的免疫原性的方法，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)向所述分离的细胞中引入核酸，所述核酸包含：(i)编码可操作地连接到免疫抑制因子的诱导型降解决定子元件的序列或(ii)编码可操作地连接到诱导型降解决定子元件的免疫抑制因子的序列，以产生工程化细胞；以及(c)将所述工程化细胞暴露于外源因子以激活所述诱导型降解决定子元件，从而控制所述工程化细胞的所述免疫原性。3.一种用于控制工程化细胞的免疫原性的方法，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)向所述分离的细胞中引入：(i)第一构建体，所述第一构建体从5'端到3'端包含：第一启动子和免疫抑制因子基因；(ii)第二构建体，所述第二构建体从5'端到3'端包含：第二启动子和编码Cas9或其变体的核酸序列；和(ii)第三构建体，所述第三构建体从5'端到3'端包含：诱导型RNA聚合酶启动子、靶向所述免疫抑制因子的引导RNA(gRNA)序列、第三启动子和对应于所述诱导型RNA聚合酶启动子的反式激活因子元件；以及(c)将所述工程化细胞暴露于外源因子以激活所述反式激活因子元件，从而控制所述工程化细胞的所述免疫原性。4.一种用于控制工程化细胞的免疫原性的方法，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)向所述分离的细胞中引入(i)包含可操作地连接到免疫信号传导因子基因的诱导型RNA聚合酶启动子的核酸和(ii)包含可操作地连接到对应于所述诱导型RNA聚合酶启动子的反式激活因子元件的启动子的核酸，以产生工程化细胞；以及(c)将所述工程化细胞暴露于外源因子以激活所述反式激活因子元件，从而控制所述工程化细胞的所述免疫原性。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(c)之前将所述工程化细胞施用于受试者。6.如权利要求1或5所述的方法，其中步骤(b)包括向所述分离的细胞中引入单一核酸构建体，所述单一核酸构建体包含(i)可操作地连接到靶向所述免疫抑制因子的所述shRNA序列的所述诱导型RNA聚合酶启动子和(ii)可操作地连接到所述反式激活因子元件的所述启动子。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述构建体从5'端到3'端包含：所述诱导型RNA聚合酶启动子、所述shRNA序列、所述启动子和所述反式激活因子元件。8.如权利要求4或5所述的方法，其中步骤(b)包括向所述分离的细胞中引入单一核酸构建体，所述单一核酸构建体包含(i)可操作地连接到所述免疫信号传导因子基因的所述诱导型RNA聚合酶启动子和(ii)可操作地连接到所述反式激活因子元件的所述启动子。9.如权利要求4、5或8中任一项所述的方法，其中所述构建体从5'端到3'端包含：所述诱导型RNA聚合酶启动子、所述免疫信号传导因子基因、所述启动子和所述反式激活因子元件。10.如权利要求1或5
‑
7中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞被工程化为外源地表达所述免疫抑制因子。11.如权利要求1或5
‑
7或10中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞在不存在激活所述反式激活因子元件的所述外源因子的情况下过表达所述免疫抑制因子。12.如权利要求1或5
‑
7或10
‑
11中任一项所述的方法，其中所述诱导型RNA聚合酶启动子是U6Tet启动子。13.如权利要求3或5所述的方法，其中所述诱导型RNA聚合酶启动子是U6Tet启动子，所述反式激活因子元件是Tet阻遏因子元件，并且所述外源因子是四环素或其衍生物。14.如权利要求4、5或8
‑
9中任一项所述的方法，其中所述诱导型RNA聚合酶启动子是TRE启动子并且所述反式激活因子元件是Tet
‑
On元件，并且所述外源因子是四环素或其衍生物。15.如权利要求2或5所述的方法，其中柔性接头将所述诱导型降解决定子元件连接到所述免疫抑制因子。16.如权利要求15所述的方法，其中所述柔性接头选自由(GSG)
n
(SEQ ID NO:3)、(GGGS)
n
(SEQ ID NO:1)和(GGGSGGGS)
n
(SEQ ID NO:2)组成的组，其中n为1
‑
10。17.如权利要求1、5或15
‑
16中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括向所述分离的细胞中引入单一核酸构建体，所述单一核酸构建体包含可操作地连接到所述核酸的启动子。18.如权利要求1
‑
4或17中任一项所述的方法，其中所述启动子是选自由以下组成的组的组成型启动子：EF1A启动子、EFS启动子、CMV启动子、CAGGS启动子、SV40启动子、COPIA启动子、ACT5C启动子、TRE启动子、CBh启动子、PGK启动子和UBC启动子。19.如权利要求3、5或13中任一项所述的方法，其中所述第一启动子、第二启动子和/或第三启动子是各自独立地选自由以下组成的组的组成型启动子：EF1A启动子、EFS启动子、CMV启动子、CAGGS启动子、SV40启动子、COPIA启动子、ACT5C启动子、TRE启动子、CBh启动子、PGK启动子和UBC启动子。20.如权利要求1
‑
3或5
‑
19中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制因子选自由以下组成的组：CD47、CD24、CD200、HLA
‑
G、HLA
‑
E、HLA
‑
C、HLA
‑
E重链、PD
‑
L1、IDO1、CTLA4
‑
Ig、C1抑制剂、IL
‑
10、IL
‑
35、FASL、Serpinb9、CC121和Mfge8。21.如权利要求1、5
‑
14或17
‑
20中任一项所述的方法，其中所述构建体从5'端到3'端包含：U6Tet启动子、靶向CD47的shRNA序列、EF1a启动子和Tet阻遏因子元件，并且其中所述外源因子是四环素或其衍生物。22.如权利要求1、6
‑
14或17
‑
20中任一项所述的方法，其中所述构建体还包含用于慢病
毒表达的载体骨架。23.如权利要求2、5或8
‑
20中任一项所述的方法，其中所述诱导型降解决定子元件选自由配体诱导型降解决定子元件、肽降解决定子元件和肽蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)元件组成的组。24.如权利要求23所述的方法，其中所述配体诱导型降解决定子元件选自小分子辅助关闭(SMASH)降解决定子元件、Shield
‑
1响应型降解决定子元件、生长素响应型降解决定子元件和雷帕霉素响应型降解决定子元件。25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述配体诱导型降解决定子元件是小分子辅助关闭(SMASH)降解决定子元件并且所述外源因子是阿孙普韦。26.如权利要求17
‑
18、20或23
‑
25中任一项所述的方法，其中所述构建体还包含用于靶向整合至安全港基因座的5'同源臂和3'同源臂，所述安全港基因座选自由AAVS1基因座、CLBYL基因座、CXCR4基因座、Rosa26基因座和CCR5基因座组成的组。27.如权利要求1
‑
4和5
‑
26中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞是分离的人细胞，与未修饰的人细胞相比，所述分离的人细胞还包含MHC I类人白细胞抗原的缺失或降低表达和/或MHC II类人白细胞抗原的缺失或降低表达。28.如权利要求1
‑
4和5
‑
27中任一项所述的方法，其中所述分离的人细胞还包含CIITA、B2M和/或NLRC5的缺失或降低表达。29.如权利要求1
‑
4和5
‑
28中任一项所述的方法，其中所述分离的人细胞是低免疫原性的，并且是干细胞或其分化细胞；其中所述干细胞选自由胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞和成体干细胞组成的组，并且其中所述分化细胞选自由心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞组成的组。30.如权利要求29所述的方法，其中所述分化细胞是胰腺细胞。31.一种构建体，所述构建体从5'端到3'端包含：诱导型RNA聚合酶启动子；靶向免疫抑制因子的shRNA序列；组成型启动子；以及对应于所述诱导型RNA聚合酶启动子的反式激活因子元件。32.一种构建体，所述构建体从5'端到3'端包含：诱导型RNA聚合酶启动子；免疫信号传导因子基因；启动子；以及对应于所述诱导型RNA聚合酶启动子的反式激活因子元件。33.如权利要求31所述的构建体，其中所述诱导型RNA聚合酶启动子是U6Tet启动子。34.如权利要求32所述的构建体，其中所述诱导型RNA聚合酶启动子是TRE启动子。35.如权利要求31或33所述的构建体，其中所述免疫抑制因子选自由以下组成的组：CD47、CD24、CD200、HLA
‑
G、HLA
‑
E、HLA
‑
C、HLA
‑
E重链、PD
‑
L1、IDO1、CTLA4
‑
Ig、C1抑制剂、IL
‑
10、IL
‑
35、FASL、Serpinb9、CC121和Mfge8。36.如权利要求32或34所述的构建体，其中所述免疫信号传导因子选自由以下组成的组：B2M、MIC
‑
A、MIC
‑
B、HLA
‑
A、HLA
‑
B、HLA
‑
C、RFXANK、CTLA
‑
4、PD
‑
1、RAET1E/ULBP4、RAET1G/ULBP5、RAET1H/ULBP2、RAET1/ULBP1、RAET1L/ULBP6、RAET1N/ULBP3和NKG2D的其他配体。37.如权利要求31
‑
36中任一项所述的构建体，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：EF1A启动子、EFS启动子、CMV启动子、CAGGS启动子、SV40启动子、COPIA启动子、ACT5C启动子、TRE启动子、CBh启动子、PGK启动子和UBC启动子。38.如权利要求31、33、35或37中任一项所述的构建体，所述构建体从5'端到3'端包含：
U6Tet启动子、靶向CD47的shRNA序列、EF1a启动子和Tet阻遏因子元件。39.如权利要求32、34、36或37中任一项所述的构建体，所述构建体从5'端到3'端包含：TRE启动子、免疫信号传导因子基因、EF1a启动子和Tet
‑
On元件。40.如权利要求31
‑
39中任一项所述的构建体，所述构建体还包含用于慢病毒表达的载体骨架。41.一种组合物，所述组合物包含分离的细胞，所述分离的细胞包含如权利要求31
‑
40中任一项所述的构建体。42.一种组合物，所述组合物包含分离的细胞，所述分离的细胞包含如权利要求31、33或35
‑
38中任一项所述的构建体，其中所述分离的细胞被工程化为外源地表达所述免疫抑制因子。43.如权利要求42所述的组合物，其中所述分离的细胞在不存在激活所述反式激活因子元件的所述外源因子的情况下过表达所述免疫抑制因子。44.如权利要求40
‑
43中任一项所述的组合物，其中将所述分离的细胞暴露于外源因子以激活所述反式激活因子元件。45.如权利要求41
‑
44中任一项所述的组合物，其中所述分离的细胞是干细胞，所述干细胞选自由胚胎干细胞、多能干细胞和成体干细胞组成的组。46.一种组合物，所述组合物包含分离的分化细胞，所述分离的分化细胞通过在适合于将干细胞分化成选自由心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞组成的组的细胞类型的分化条件下培养如权利要求45所述的干细胞而制备。47.一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，所述方法包括：(a)将如权利要求46所述的组合物施用于患者；以及(b)将所述组合物暴露于外源因子以激活所述诱导型RNA聚合酶启动子，从而控制所述组合物的所述细胞的免疫原性。48.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)MHC I类分子和/或MHC II类分子的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)选自由靶向CD47的诱导型shRNA、控制CD47的诱导型降解决定子元件或控制CD47的SMASH降解决定子元件组成的组的因子。49.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)B2M和CIITA的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)选自由靶向CD47的诱导型shRNA、控制CD47的诱导型降解决定子元件或控制CD47的SMASH降解决定子元件组成的组的因子。50.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)MHC I类分子和/或MHC II类分子的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，(iii)Cas9或其变体，以及(iv)靶向CD47的诱导型引导RNA。51.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)B2M和CIITA的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，(iii)Cas9或其变体，以及(iv)靶向CD47的诱导型引导RNA。52.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)MHC I类分子和/或MHC II类分子的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)用于调节CD47的表达的诱导型蛋白质降解系统，所述诱导型蛋白质降解系统选自由以下组成的组：小分子辅助关闭(SMASH)系统、Shield
‑
1诱导型降解决定子、生长素诱导型降解决定子、IMid诱导型降解决定子、肽降解决
定子、蛋白水解靶向嵌合体和用于靶向降解的抗体。53.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)B2M和CIITA的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)用于调节CD47的表达的诱导型蛋白质降解系统，所述诱导型蛋白质降解系统选自由以下组成的组：小分子辅助关闭(SMASH)系统、Shield
‑
1诱导型降解决定子、生长素诱导型降解决定子、IMid诱导型降解决定子、肽降解决定子、蛋白水解靶向嵌合体和用于靶向降解的抗体。54.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)MHC I类分子和/或MHC II类分子的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)用于调节CD47的表达的RNA调节系统，所述系统选自由诱导型shRNA、诱导型siRNA、CRISPR干扰(CRISPRi)和RNA靶向核酸酶系统组成的组。55.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)B2M和CIITA的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)用于调节CD47的表达的RNA调节系统，所述系统选自由诱导型shRNA、诱导型siRNA、CRISPR干扰(CRISPRi)和RNA靶向核酸酶系统组成的组。56.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)MHC I类分子和/或MHC II类分子的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)用于调节CD47的表达的DNA调节系统，所述系统选自由组织特异性启动子表达系统、诱导型启动子表达系统、分子调节的核糖开关系统和基于诱导型核酸酶的基因组编辑系统组成的组。57.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)B2M和CIITA的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)用于调节CD47的表达的DNA调节系统，所述系统选自由组织特异性启动子表达系统、诱导型启动子表达系统、分子调节的核糖开关系统和基于诱导型核酸酶的基因组编辑系统组成的组。58.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)MHC I类分子和/或MHC II类分子的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)用于调节CD47的表达的诱导型系统。59.一种多能干细胞，所述多能干细胞包含(i)B2M和CIITA的降低或沉默表达，(ii)CD47的过表达，以及(iii)用于调节CD47的表达的诱导型系统。60.一种分化细胞，所述分化细胞衍生自如权利要求48
‑
59中任一项所述的多能干细胞，其中所述分化细胞选自由心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞组成的组。61.一种构建体，所述构建体从5'端到3'端包含：启动子、诱导型降解决定子元件、编码柔性接头的任选序列和免疫抑制因子基因。62.一种构建体，所述构建体从5'端到3'端包含：启动子、免疫抑制因子基因、编码柔性接头的任选序列和诱导型降解决定子元件。63.如权利要求61或62所述的构建体，其中所述启动子是选自由以下组成的组的组成型启动子：EF1A启动子、EFS启动子、CMV启动子、CAGGS启动子、SV40启动子、COPIA启动子、ACT5C启动子、TRE启动子、CBh启动子、PGK启动子和UBC启动子。64.如权利要求61
‑
63中任一项所述的构建体，其中所述柔性接头选自由(GSG)
n
(SEQ ID NO:3)、(GGGS)
n
(SEQ ID NO:1)和(GGGSGGGS)
n
(SEQ ID NO:2)组成的组，其中n为1
‑
10。65.如权利要求61
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64中任一项所述的构建体，其中所述免疫抑制因子选自由以下组成的组：CD47、CD24、CD200、HLA
‑
G、HLA
‑
E、HLA
‑
C、HLA
‑
E重链、PD
‑
L1、IDO1、CTLA4
‑
Ig、C1抑制剂、IL
‑
10、IL
‑
35、FASL、Serpinb9、CC121和Mfge8。
66.如权利要求61
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65中任一项所述的构建体，其中所述诱导型降解决定子元件选自由配体诱导型降解决定子元件、诱导型肽降解决定子元件和肽蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)元件组成的组。67.如权利要求66所述的构建体，其中所述配体诱导型降解决定子元件选自小分子辅助关闭(SMASH)降解决定子元件、Shield
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1响应型降解决定子元件、生长素响应型降解决定子元件和雷帕霉素响应型降解决定子元件。68.如权利要求61
‑
67中任一项所述的构建体，所述构建体还包含用于靶向整合至基因组安全港基因座的5'同源臂和3'同源臂，所述基因组安全港基因座选自由AAVS1基因座、CLBYL基因座、CXCR4基因座、Rosa26基因座和CCR5基因座组成的组。69.一种组合物，所述组合物包含分离的细胞，所述分离的细胞包含如权利要求61
‑
68中任一项所述的构建体。70.如权利要求69所述的组合物，其中所述分离的细胞是干细胞，所述干细胞选自由干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞和成体干细胞组成的组。71.一种组合物，所述组合物包含分离的分化细胞，所述分离的分化细胞通过在适合于将干细胞分化成选自由心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞组成的组的细胞类型的分化条件下培养如权利要求70所述的干细胞而制备。72.一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，所述方法包括：(a)将如权利要求71所述的组合物施用于所述患者；以及(b)将所述组合物暴露于外源因子以激活所述诱导型降解决定子元件，从而控制所述组合物的所述细胞的免疫原性。73.一种组合物，所述组合物包含分离的细胞，所述分离的细胞包含用于控制所述细胞的免疫原性的DNA靶向核酸酶系统，所述系统包含：(a)第一元件，所述第一元件从5'端到3'端包含：第一启动子和免疫抑制因子基因；(b)第二元件，所述第二元件从5'端到3'端包含：第二启动子和编码Cas9或其变体的核酸序列；以及(c)第三元件，所述第三元件从5'端到3'端包含：诱导型RNA聚合酶启动子、靶向所述免疫抑制因子的引导RNA(gRNA)序列、第三启动子和对应于所述诱导型启动子的反式激活因子元件。74.如权利要求73所述的组合物，其中在将所述细胞暴露于外源因子以诱导所述反式激活因子元件的活性时，所述细胞的免疫原性是可控的。75.如权利要求73或74所述的组合物，其中所述诱导型RNA聚合酶启动子是U6Tet启动子，所述反式激活因子元件是Tet阻遏因子元件，并且所述外源因子是四环素或其衍生物。76.如权利要求73
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75中任一项所述的组合物，其中所述免疫抑制因子选自由以下组成的组：CD47、CD24、CD200、HLA
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G、HLA
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E、HLA
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C、HLA
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E重链、PD
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L1、IDO1、CTLA4
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Ig、C1抑制剂、IL
‑
10、IL
‑
35、FASL、Serpinb9、CC121和Mfge8。77.如权利要求73
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76中任一项所述的组合物，其中所述第一启动子、第二启动子和/或第三启动子是各自独立地选自由以下组成的组的组成型启动子：EF1A启动子、EFS启动子、CMV启动子、CAGGS启动子、SV40启动子、COPIA启动子、ACT5C启动子、TRE启动子、CBh启动子、
PGK启动子和UBC启动子。78.如权利要求73
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77中任一项所述的组合物，其中所述分离的细胞是分离的工程化人细胞，与未修饰的人细胞相比，所述分离的工程化人细胞还包含MHC I类人白细胞抗原的缺失或降低表达和/或MHC II类人白细胞抗原的缺失或降低表达。79.如权利要求78所述的组合物，其中所述分离的人细胞还包含CIITA、B2M和/或NLRC5的缺失或降低表达。80.如权利要求78或79所述的组合物，其中所述分离的人细胞是低免疫原性的并且是干细胞。81.一种组合物，所述组合物包含分离的分化细胞，所述分离的分化细胞通过在适合于将干细胞分化成选自由心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞组成的组的细胞类型的分化条件下培养如权利要求80所述的干细胞而制备。82.一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，所述方法包括：(a)施用如权利要求81所述的组合物；以及(b)将所述组合物暴露于外源因子以激活所述诱导型RNA聚合酶启动子，从而控制所述组合物的所述细胞的免疫原性。83.一种组合物，所述组合物包含分离的哺乳动物细胞，所述分离的哺乳动物细胞包含修饰，所述修饰包含编码用于条件性表达一种或多种免疫抑制因子的系统的重组核酸序列。84.一种组合物，所述组合物包含分离的哺乳动物细胞，所述分离的哺乳动物细胞包含编码用于条件性表达一种或多种免疫抑制因子的系统的重组核酸序列。85.如权利要求83所述的组合物，其中所述一种或多种免疫抑制因子的表达可通过外源因子控制。86.如权利要求84所述的组合物，其中所述一种或多种免疫信号传导因子的表达可通过外源因子控制。87.如权利要求83或85所述的组合物，其中所述系统包括诱导型蛋白质降解系统以降低所述一种或多种免疫抑制因子的蛋白质水平。88.如权利要求87所述的组合物，其中所述诱导型蛋白质降解系统选自由以下组成的组：小分子辅助关闭(SMASH)系统、Shield
‑
1诱导型降解决定子、生长素诱导型降解决定子、IMid诱导型降解决定子、肽降解决定子、蛋白水解靶向嵌合体和用于靶向降解的抗体。89.如权利要求83或85所述的组合物，其中所述系统包括RNA调节系统以可控地降低所述一种或多种免疫抑制因子的RNA水平。90.如权利要求89所述的组合物，其中所述RNA调节系统选自由诱导型shRNA、诱导型siRNA、CRISPR干扰(CRISPRi)和RNA靶向核酸酶系统组成的组。91.如权利要求90所述的组合物，所述RNA调节系统可通过配体诱导型转录因子、SynNotch受体或配体调节的核糖开关控制。92.如权利要求83或85所述的组合物，其中所述系统包括DNA调节系统以降低所述一种或多种免疫抑制因子的表达水平，所述系统选自由组织特异性启动子表达系统、诱导型启动子表达系统、分子调节的核糖开关系统和基于诱导型核酸酶的基因组编辑系统组成的
组。93.如权利要求92所述的组合物，其中所述诱导型启动子表达系统包含U6Tet启动子和Tet阻遏因子元件。94.如权利要求84或86所述的组合物，其中所述系统包括诱导型蛋白质稳定系统以增加所述一种或多种免疫信号传导因子的蛋白质水平。95.如权利要求94所述的组合物，其中所述诱导型蛋白质稳定系统包括配体诱导型蛋白质稳定系统和小分子诱导型蛋白质稳定系统。96.如权利要求84或86所述的组合物，其中所述系统包含RNA调节系统以增加所述一种或多种免疫信号传导因子的RNA水平。97.如权利要求96所述的组合物，其中所述RNA调节系统包括CRISPR激活(CRISPRa)系统。98.如权利要求84或86所述的组合物，其中所述系统包括DNA调节系统以增加所述一种或多种免疫信号传导因子的表达水平。99.如权利要求98所述的组合物，其中所述DNA调节系统包括选自由CRISPR激活(CRISPRa)系统、组织特异性启动子、诱导型启动子和分子调节的核糖开关系统组成的组的一种或多种DNA调节系统。100.如权利要求92或99所述的组合物，其中所述组织特异性启动子选自由以下组成的组：心脏细胞特异性启动子、肝脏细胞特异性启动子、肾脏细胞特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子、神经细胞特异性启动子、免疫细胞特异性启动子、间充质细胞特异性启动子和内皮细胞特异性启动子。101.如权利要求99所述的组合物，其中所述诱导型启动子包含TetOn系统。102.如权利要求92或99所述的组合物，其中所述分子调节的核糖开关系统包含茶碱调节的核糖开关或鸟嘌呤调节的核糖开关。103.如权利要求92所述的组合物，其中所述基于诱导型核酸酶的基因组编辑系统包含选自由以下组成的组的一种：包含靶向所述一种或多种免疫抑制因子的诱导型引导RNA的CRISPR基因组编辑、诱导型TALEN基因组编辑、诱导型ZFN基因组编辑和小分子增强的基于CRISPR的基因组编辑。104.如权利要求83、85、87
‑
93、100或102
‑
103中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种免疫抑制因子选自由以下组成的组：CD47、CD24、CD200、HLA
‑
G、HLA
‑
E、HLA
‑
C、HLA
‑
E重链、PD
‑
L1、IDO1、CTLA4
‑
Ig、C1抑制剂、IL
‑
10、IL
‑
35、FASL、Serpinb9、CC121和Mfge8。105.如权利要求84、86或94
‑
102中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种免疫信号传导因子选自由以下组成的组：β
‑2‑
微球蛋白(B2M)、MHC I类链相关蛋白A(MIC
‑
A)、MHC I类链相关蛋白B(MIC
‑
B)、HLA
‑
A、HLA
‑
B、HLA
‑
C、RFXANK、CTLA
‑
4、PD
‑
1、RAET1E/ULBP4、RAET1G/ULBP5、RAET1H/ULBP2、RAET1/ULBP1、RAET1L/ULBP6、RAET1N/ULBP3和NKG2D的其他配体。106.如权利要求83
‑
105中任一项所述的组合物，其中所述分离的哺乳动物细胞是分离的工程化人细胞，与未修饰的人细胞相比，所述分离的工程化人细胞还包含MHC I类人白细胞抗原的缺失或降低表达和/或MHC II类人白细胞抗原的缺失或降低表达。107.如权利要求106所述的组合物，其中所述分离的工程化人细胞还包含CIITA、B2M
和/或NLRC5的缺失或降低表达。108.如权利要求106
‑
107中任一项所述的组合物，其中所述分离的工程化人细胞是低免疫原性的并且是干细胞。109.一种组合物，所述组合物包含分离的分化细胞，所述分离的分化细胞通过在适合于将干细胞分化成选自由心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞组成的组的细胞类型的分化条件下培养如权利要求108所述的干细胞而制备。110.一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，所述方法包括：(a)施用如权利要求109所述的组合物；以及(b)将所述组合物暴露于外源因子以控制所述一种或多种免疫抑制因子的表达，从而控制所述组合物的所述细胞的免疫原性。111.一种构建体，所述构建体从5'到3'端包含：(1)安全开关转基因；(2)核糖体跳跃序列和/或编码接头的序列；(3)低免疫性基因。112.一种构建体，所述构建体从5'到3'端包含：(1)低免疫性基因；(2)核糖体跳跃序列或接头；(3)安全开关转基因。113.如权利要求111或112所述的构建体，其中所述安全开关转基因选自由以下组成的组：HSVtk基因、胞嘧啶脱氨酶基因、硝基还原酶基因、嘌呤核苷磷酸化酶基因、辣根过氧化物酶基因、iCaspase9基因、HER1转基因、RQR8转基因、CD20转基因、CCR4转基因、HER2转基因、CD19转基因、MUC1转基因、EGFR转基因、GD2转基因、PSMA转基因、CD16转基因和CD30转基因。114.如权利要求101
‑
103中任一项所述的构建体，其中所述核糖体跳跃序列包含编码IRES序列的序列或编码2A编码序列的序列。115.如权利要求111
‑
114中任一项所述的构建体，其中所述接头选自表3中提供的任何一种接头。116.如权利要求111
‑
115中任一项所述的构建体，其中所述低免疫性基因选自由以下组成的组：CD47、CD24、CD200、HLA
‑
G、HLA
‑
E、HLA
‑
C、HLA
‑
E重链、PD
‑
L1、1DO1、CTLA4
‑
Ig、IL
‑
10、IL
‑
35、FASL、Serpinb9、CC121和Mfge8。117.如权利要求111或113
‑
116中任一项所述的构建体，所述构建体还包含可操作地连接到所述安全开关转基因的转录调控元件和在所述低免疫性基因的3'端处的多聚腺苷酸化序列，或者可操作地连接到所述低免疫性基因的转录调控元件和在所述安全开关转基因的3'端处的多聚腺苷酸化序列。118.如权利要求111
‑
117中任一项所述的构建体，其中所述转录调控元件选自由以下组成的组：EF1A启动子、EFS启动子、CMV启动子、CAGGS启动子、SV40启动子、COPIA启动子、ACT5C启动子、TRE启动子、CBh启动子、PGK启动子和UBC启动子。119.如权利要求111
‑
118中任一项所述的构建体，所述构建体还包含用于慢病毒表达的载体骨架。120.一种将构建体递送到分离的细胞中的方法，所述方法包括用包含如权利要求119所述的构建体的慢病毒构建体转导分离的细胞；以及选择携带所述安全开关转基因和所述低免疫性基因的工程化细胞。
121.一种分离的细胞或其群体，所述分离的细胞或其群体包含如权利要求111
‑
119中任一项所述的构建体。122.如权利要求121所述的分离的细胞或其群体，其中所述构建体已被引入靶基因座。123.如权利要求121或122所述的分离的细胞或其群体，其中所述靶基因座是选自由AAVS1基因座、CLBYL基因座、CXCR4基因座、Rosa26基因座和CCR5基因座组成的组的安全港基因座，或者选自由B2M、HLA
‑
A、HLA
‑
B、HLA
‑
C、HLA
‑
D、HLA
‑
E、RFXANK、CIITA、CTLA
‑
4、PD
‑
1、RAET1E/ULBP4、RAET1G/ULBP5、RAET1H/ULBP2、RAET1/ULBP1、RAET1L/ULBP6、RAET1N/ULBP3和NKG2D的其他配体组成的组的免疫信号传导基因座。124.如权利要求121
‑
123中任一项所述的分离的细胞或其群体，其中所述分离的细胞是分离的工程化人细胞，与未修饰的人细胞相比，所述分离的工程化人细胞还包含MHC I类人白细胞抗原的缺失或降低表达和/或MHC II类人白细胞抗原的缺失或降低表达。125.如权利要求121
‑
124中任一项所述的分离的细胞或其群体，其中所述分离的细胞还包含CIITA、B2M和/或NLRC5的缺失或降低表达。126.如权利要求121
‑
125中任一项所述的分离的细胞或其群体，其中所述分离的细胞是低免疫原性的并且是干细胞。127.一种分化细胞或其群体，所述分化细胞或其群体通过在适合于将干细胞分化成选自由心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞组成的组的细胞类型的分化条件下培养如权利要求126所述的干细胞而制备。128.一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，所述方法包括向患者施用如权利要求127所述的分化细胞或其群体。129.一种治疗患者的方法，所述方法包括激活在先前施用如权利要求127所述的分化细胞或其群体的患者中的安全开关。130.一种用于同源定向修复到安全港基因座中的构建体，所述构建体从5'到3'端包含：(1)与安全港基因座的第一内源序列同源的第一同源臂；(2)安全开关转基因；(3)核糖体跳跃序列和/或编码接头的序列；(4)低免疫性基因；(5)多聚腺苷酸化序列；以及(6)与所述安全港基因座的第二内源序列同源的第二同源臂。131.一种用于同源定向修复到安全港基因座中的构建体，所述构建体从5'到3'端包含：(1)与免疫信号传导基因座的第一内源序列同源的第一同源臂；(2)安全开关转基因；(3)核糖体跳跃序列和/或编码接头的序列；(4)低免疫性基因；(5)多聚腺苷酸化序列；以及(6)与所述免疫信号传导基因座的第二内源序列同源的第二同源臂。132.一种用于同源定向修复到安全港基因座中的构建体，所述构建体从5'到3'端包含：(1)与安全港基因座的第一内源序列同源的第一同源臂；(2)安全开关转基因；(3)核糖体跳跃序列或编码接头的序列；(4)必需细胞因子基因；(5)多聚腺苷酸化序列；以及(6)与所述安全港基因座的第二内源序列同源的第二同源臂。133.一种用于同源定向修复到免疫信号传导中的构建体，所述构建体从5'到3'端包含：(1)与免疫信号传导基因座的第一内源序列同源的第一同源臂；(2)安全开关转基因；(3)核糖体跳跃序列或编码接头的序列；(4)必需细胞因子基因；(5)多聚腺苷酸化序列；以及(6)与所述免疫信号传导基因座的第二内源序列同源的第二同源臂。134.一种用于同源定向修复到必需细胞因子基因座中的构建体，所述构建体从5'到3'
端包含：(1)与必需细胞因子基因座的第一内源序列同源的第一同源臂；(2)编码接头的序列；(3)安全开关转基因；以及(4)与所述必需细胞因子基因座的第二内源序列同源的第二同源臂。135.如权利要求130或131所述的构建体，其中所述低免疫性基因选自由以下组成的组：CD47、CD24、CD200、HLA
‑
G、HLA
‑
E、HLA
‑
C、HLA
‑
E重链、PD
‑
L1、1DO1、CTLA4
‑
Ig、IL
‑
10、IL
‑
35、FASL、Serpinb9、CC121和Mfge8。136.如权利要求132或133所述的构建体，其中所述必需细胞因子选自由以下组成的组：RpS2、RpS9、RpS11、RpS13、RpS18、RpL8、RpL11、RpL32、RpL36、Rpn22、Psmd14、PSMA3、核糖体亚基蛋白、蛋白酶体亚基蛋白和剪接体亚基蛋白。137.如权利要求134所述的构建体，其中所述必需细胞因子选自由以下组成的组：RpS2、RpS9、RpS11、RpS13、RpS18、RpL8、RpL11、RpL32、RpL36、Rpn22、Psmd14、PSMA3、核糖体亚基蛋白、蛋白酶体亚基蛋白和剪接体亚基蛋白。138.如权利要求130、132或135
‑
136中任一项所述的构建体，其中所述安全港基因座选自由AAVS1基因座、CLBYL基因座、CXCR4基因座、Rosa26基因座和CCR5基因座组成的组。139.如权利要求131、133或135
‑
136中任一项所述的构建体，其中所述免疫信号传导基因座选自由以下组成的组：B2M、HLA
‑
A、HLA
‑
B、HLA
‑
C、HLA
‑
D、HLA
‑
E、RFXANK、CIITA、CTLA
‑
4、PD
‑
1、RAET1E/ULBP4、RAET1G/ULBP5、RAET1H/ULBP2、RAET1/ULBP1、RAE11L/ULBP6、RAET1N/ULBP3和NKG2D的其他配体。140.如权利要求133、136或139中任一项所述的构建体，其中所述免疫信号传导基因座选自由B2M、HLA
‑
A、HLA
‑
B、HLA
‑
C、HLA
‑
D和HLA
‑
E组成的组。141.如权利要求130
‑
133、135
‑
136或138
‑
140中任一项所述的构建体，其中所述核糖体跳跃序列包含编码IRES序列的序列或编码2A编码序列的序列。142.如权利要求141所述的构建体，其中所述2A编码序列选自由T2A、P2A、E2A和F2A组成的组。143.如权利要求130
‑
133、135
‑
136或138
‑
142中任一项所述的构建体，其中所述构建体使靶向核酸酶能够切割所述安全港基因座或所述免疫信号传导基因座，从而允许所述构建体通过同源定向修复重组到所述基因座中。144.如权利要求134或137中任一项所述的构建体，其中所述构建体使靶向核酸酶能够切割所述必需细胞因子基因座，从而允许所述构建体通过同源定向修复重组到所述基因座中。145.如权利要求130
‑
144中任一项所述的构建体，所述构建体还包含位于所述安全开关转基因的5'端处的选自由以下组成的组的转录调控元件：EF1A启动子、EFS启动子、CMV启动子、CAGGS启动子、SV40启动子、COPIA启动子、ACT5C启动子、TRE启动子、CBh启动子、PGK启动子和UBC启动子。146.如权利要求130
‑
145中任一项所述的构建体，其中所述安全开关转基因选自由以下组成的组：HSVtk基因、胞嘧啶脱氨酶基因、硝基还原酶基因、嘌呤核苷磷酸化酶基因、辣根过氧化物酶基因、iCaspase9基因、HER1转基因、RQR8转基因、CD20转基因、CCR4转基因、HER2转基因、CD19转基因、MUC1转基因、EGFR转基因、GD2转基因、PSMA转基因、CD16转基因和CD30转基因。
147.如权利要求130
‑
146中任一项所述的构建体，其中所述接头选自表3中提供的任何一种接头。148.一种分离的细胞或其群体，所述分离的细胞或其群体包含整合到安全港基因座或免疫信号传导基因座中的安全开关转基因和低免疫性基因，其中如权利要求130、135、138、141
‑
143或145
‑
147中任一项所述的构建体已重组到细胞的所述内源安全港基因座中，或者其中如权利要求131、135或135
‑
147中任一项所述的构建体已重组到细胞的所述内源免疫信号传导基因座中。149.一种分离的细胞或其群体，所述分离的细胞或其群体包含整合到安全港基因座或免疫信号传导基因座中的安全开关转基因和必需细胞因子基因，其中如权利要求132、136、138、141、143或145
‑
147中任一项所述的构建体已重组到细胞的所述内源安全港基因座中，或者其中如权利要求133、136、139
‑
143或145
‑
147中任一项所述的构建体已重组到细胞的所述内源免疫信号传导基因座中，并且其中所述细胞或其群体不能从所述内源基因座表达所述必需细胞因子。150.如权利要求148或149所述的分离的细胞或其群体，其中所述分离的细胞是分离的工程化人细胞，与未修饰的人细胞相比，所述分离的工程化人细胞还包含MHC I类人白细胞抗原的缺失或降低表达和/或MHC II类人白细胞抗原的缺失或降低表达。151.如权利要求148
‑
150中任一项所述的分离的细胞或其群体，其中所述分离的细胞还包含CIITA、B2M和/或NLRC5的缺失或降低表达。152.如权利要求148
‑
151中任一项所述的分离的细胞或其群体，其中所述分离的细胞是低免疫原性的并且是干细胞。153.一种分化细胞或其群体，所述分化细胞或其群体通过在适合于将干细胞分化成选自由心脏细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、神经细胞、免疫细胞、间充质细胞和内皮细胞组成的组的细胞类型的分化条件下培养如权利要求152所述的干细胞而制备。154.一种治疗需要细胞疗法的患者的方法，所述方法包括向患者施用如权利要求153所述的分化细胞或其群体。155.一种治疗患者的方法，所述方法包括激活在先前施用如权利要求153所述的分化细胞或其群体的患者中的安全开关。156.一种同源独立供体构建体，所述供体构建体从5'到3'端包含：(1)包含左元件(LE)的5'长末端重复序列(LTR)；(2)剪接受体
‑
病毒2A肽(SA
‑
2A)元件；(3)安全开关转基因；(4)核糖体跳跃序列或编码接头的序列；(5)低免疫性基因；(6)多聚腺苷酸化序列；以及(7)包含右元件(RE)的3'LTR。157.一种同源独立供体构建体，所述供体构建体从5'到3'端包含：(1)包含左元件(LE)的5'长末端重复序列(LTR)；(2)剪接受体
‑
病毒2A肽(SA
‑
2A)元件；(3)安全开关转基因；(4)核糖体跳跃序列或编码接头的序列；(5)必需细胞因子基因；(6)多聚腺苷酸化序列；以及(7)包含右元件(RE)的3'LTR。158.一种同源独立供体构建体，所述供体构建体从5'到3'端包含：(1)包含左元件(LE)的5'长末端重复序列(LTR)；(2)剪接受体
‑
病毒2A肽(SA
‑
2A)元件；(3)必需细胞因子基因；(4)核糖体跳跃序列或编码接头的序列；(5)安全开关转基因；(6)多聚腺苷酸化序列；以及(7)包含右元件(RE)的3'LTR。
159.如权利要求156所述的构建体，其中所述低免疫性基因选自由以下组成的组：CD47、CD24、CD200、HLA
‑
G、HLA
‑
E、HLA
‑
C、HLA
‑
E重链、PD
‑
L1、1DO1、CTLA4
‑
Ig、IL
‑
10、IL
‑
35、FASL、Serpinb9、CC121和Mfge8。160.如权利要求157或158所述的构建体，其中所述必需细胞因子选自由以下组成的组：RpS2、RpS9、RpS11、RpS13、RpS18、RpL8、RpL11、RpL32、RpL36、Rpn22、Psmd14、PSMA3、核...
【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：萨那生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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