一种重组载体CTE528及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组载体CTE528及其构建方法和应用，属于基因工程领域。本发明专利技术针对微藻转基因的研究大都集中在模式藻莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的缺点，提供了一种可在盐藻基因工程中高效使用的载体系统构建方法，先将CAT基因两侧添加NdeⅠ后，克隆至pBI221

【技术实现步骤摘要】
Marker；1：CTE528
‑
PCR产物Ⅰ；2：CTE528
‑
PCR产物Ⅱ。
[0015]图4为被酶切的质粒CTE527
‑
2的扩增产物凝胶电泳图，其中M2：λ
‑
HindⅢdigest；1：CTE527
‑2‑
plasmid；2：CTE527
‑2‑
Sse8387Ⅰ/BamHⅠ；M1：DL2000 DNA Marker。
[0016]图5为本专利技术构建的中间载体CTE527示意图。
[0017]图6为本专利技术构建的重组载体CTE528示意图。
具体实施方式
[0018]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0019]下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
[0020]本专利技术涉及的所有引物序列见附表。
[0021]实施例1 构建CTE527载体系统
[0022](一)制作PCR扩增的模板
[0023]将质粒pCAT
‑
Control，使用HincⅡ进行酶切后，分别使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purificatcation Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收约4.1kb、350bp的2个DNA片段，并命名为CTE527template
‑
1和CTE527template
‑
2。
[0024](二)目的片段制作
[0025]1.PCR扩增
[0026]1‑
1.使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)，对CTE527template
‑
1和CTE527template
‑
2进行PCR扩增。
[0027]反应体系(50μl)：Template
*1
(约10ng/μl)1μl、Primer
*2
(20pmol/μl)0.5μl、Primer
*3
(20pmol/μl)0.5μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、5
×
PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、dH2O补至50μl，其中，
*1
代表模板CTE527template
‑
1和CTE527template
‑
2，
*2
代表引物CTE527 F01、CTE527 F02，
*3
代表引物CTE527 R02、CTE527 R01。
[0028]反应条件：98℃10sec；98℃10sec，55℃10sec，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。
[0029]1‑
2.将引物CTE527 F01/CTE527 R02、CTE527 F02/CTE527 R01的扩增产物，取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
[0030]2.PCR产物纯化
[0031]将上述PCR产物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purificatcation Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)进行切胶回收后，命名为CTE527
‑
InsertⅠ、CTE527
‑
InsertⅡ(分别是以CTE527template
‑
1和CTE527template
‑
2为模板进行PCR扩增后，PCR产物的胶纯化产物)。
[0032](三)载体制作
[0033]1.将质粒pBI221
‑
GFP，使用NdeⅠ进行酶切。
[0034]反应体系(50μl)：pBI221
‑
GFP(200ng/μl)5μl、10
×
H Buffer 5μl、NdeⅠ(10U/μl)1μl、dH2O补至50μl；37℃酶切3h。
[0035]2.取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
[0036]3.载体回收
[0037]使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purificatcation Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收约4.6kb的DNA片段后，命名为CTE527
‑
Vector。
[0038](四)In
‑
Fusion、转化、阳性克隆筛选及质粒测序
[0039]使用In
‑
Fusion HD Cloning Kit(Clontech Code No.639648)，将CTE527
‑
InsertⅠ、CTE527
‑
InsertⅡ(分别是以CTE527template
‑
1和CTE527template
‑
2为模板进行PCR扩增后，PCR产物的胶纯化产物)和CTE527
‑
Vector连接，反应体系及条件如下：
[0040]反应体系(10μl)：CTE527
‑
Vector(约100ng/μl)2μl、CTE527
‑
InsertⅠ(约50ng/μl)1μl、CTE527
‑
InsertⅡ(约50ng/μl)1μl、5xIn
‑
Fusion HD Enzyme Premix 2μl、dH2O补至10μl。
[0041]反应条件：50℃，15min。
[0042]取上述In
‑
Fusion产物2.5μl热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒命名为CTE527
‑
2。使用引物CTE527 P1、CTE527 P2、CTE527 P3对上述质粒进行测序，结果正确，载体图如图5所示。
[0043]实施例2 构建CTE528载体系统
[0044](一).目的片段制作
[0045]1.PCR扩增
[0046]1‑
1.使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)，对pGA1611
‑
Ubil和pUC57
‑
Q进行PCR扩增。
[0047]反应体系(50μl)：Template
*1
(约10ng/μl)1μl、Primer
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组载体CTE528，其特征在于，是将启动子UbiΩ和CAT基因插入载体pBI221
‑
GFP中而获得。2.根据权利要求1所述的重组载体CTE528，其特征在于，所述的启动子UbiΩ是插入至pBI221
‑
GFP中的Sse8387Ⅰ位点和BamHⅠ双酶切位点之间，所述的CAT基因是插入至pBI221
‑
GFP中的NdeⅠ单酶切位点间。3.一种构建重组载体CT...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦磊，尚常花，朱顺妮，王忠铭，
申请(专利权)人：中国科学院广州能源研究所，
类型：发明
国别省市：