一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体及其构建方法与应用，其中该微环DNA表达载体由目的基因、PPAP序列和微环DNA质粒构成，所述PPAP序列包括依次连接的polyA加尾信号、启动子、反向attB序列、ΦC31整合酶基因和终止密码子，所述反向attB序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的ΦC31整合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述终止密码子的核苷酸序列为TGA。本发明专利技术提供的微环DNA表达载体能够自发定向、特异性地整合到真核细胞基因组内假attP位点，避免质粒随机插入引起的基因表达沉默和其他安全隐患，从而使目的基因安全持续高效表达，具有较高的生物安全性。具有较高的生物安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种位点特异性整合的微环DNA表达载体及其重组母质粒，特别涉及一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]重组DNA技术的兴起和推广，使得在实验室条件下人工构建或修饰DNA分子成为了可能，这也推动了基因治疗、转基因动物研制和基因修饰等领域的发展。然而，研究者在高等动物细胞和活体基因组中进行有效的可控性基因修饰的能力十分有限。为了将外源基因整合进基因组，目前依靠的仍然是转染DNA的随机整合，不仅成本高、效率低，而且由于整合位点的随机性易引起插入突变或外源基因表达沉默。
[0003]近年来，链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能够催化链霉菌基因组中的attB位点和噬菌体基因组attP位点之间的同源重组，引起科学家的重视。由于ΦC31整合酶介导的重组具有单向整合、位点特异、无需外界化学能源和辅助因子、胜任大片段基因有效整合、可在多种高等动植物细胞中发挥作用及外源基因可长期高效表达等特点，故成为继Cre重组酶和FLP重组酶之后的又一种基因修饰的有力工具，已经越来越多地被用于基因治疗、转基因动物研制等方面，并衍生出微环DNA技术。
[0004]ΦC31整合酶识别的attB位点最小为34bp，attP位点最小为39bp，重组以两者间一段3bp重叠序列“TTG”为枢纽，将噬菌体基因组整合到细菌基因组中的attB特异位点，并形成杂合位点attL和attR。其中，attB位点的34bp核心序列为gtgccagggcgtgcccTTGggctccccgggcgcg，attP位点的39bp核心序列为ccccaactggggtaacctTTGagttctctcagttggggg。
[0005]研究表明，在人、小鼠、大鼠、果蝇、牛等真核生物基因组中存在着“假attP位点”，这些位点的序列与噬菌体attP位点的序列有显著的相似性，同样可以由ΦC31整合酶介导发生位点特异性整合反应。此外，在真核细胞中，ΦC31整合酶介导的整合多发生于转录活跃区，故有利于外源基因的表达，这也可能是整合酶介导的整合与随机整合相比普遍有较长时间高水平表达的原因。而且，整合位点不偏好于转录起始位点，Sivalingam等发现，超过70％的整合位点位于转录起始位点50kb以外。因此，从该方面来看，ΦC31整合酶介导的整合潜在的安全隐患较随机插入和病毒载体系统要小得多。
[0006]尽管传统的质粒载体和病毒载体是常被用于整合到宿主细胞染色体上的载体类型，但在实际应用中仍有一些问题难以克服。其中，病毒载体存在插入突变的风险和免疫原性，会带来诱癌风险并可能引发宿主的免疫反应，而质粒载体的随机整合同样会引起插入突变或导致外源基因的沉默。更重要地是，传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隐藏的表达信号，这些序列在质粒复制时是必需的，但在具体应用中却可能引起严重的生物安全性问题。而微环DNA是一种环状的、不包含细菌质粒骨架成分(如：抗生素抗性基因和细菌复制序列)的表达载体，在生物安全性上明显优于传统
的质粒载体和病毒载体。但是，由于微环DNA无法整合到宿主细胞染色体上，故只能在静止细胞中短暂表达所携带的外源基因。由此可见，目前仍然缺乏安全、可靠、具有整合功能的表达载体系统。

技术实现思路

[0007]本专利技术解决的问题在于提供一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体及其重组母质粒的构建方法和应用，克服现有载体系统进行外源基因整合方面存在的缺陷，为外源基因整合入宿主细胞染色体提供可自发定向整合假attP位点且无细菌质粒骨架成分的微环DNA表达载体，提高外源基因整合的安全性和可靠性。
[0008]根据本专利技术第一方面，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体，该微环DNA表达载体由目的基因、PPAP序列和微环DNA质粒构成，通过在所述微环DNA质粒的多克隆位点插入所述PPAP序列和目的基因形成重组母质粒，再将所述重组母质粒在工程菌内发生分子内位点特异性重组而形成所述微环DNA表达载体，其中所述PPAP序列包括依次连接的polyA加尾信号、启动子、反向attB序列、ΦC31整合酶基因和终止密码子，所述反向attB序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的ΦC31整合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述终止密码子的核苷酸序列为TGA，所述目的基因为需要整合入宿主细胞染色体的外源基因片段。
[0010]优选地，所述微环DNA质粒为pMC.CMV
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MCS
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SV40polyA质粒或pMC.EF1α
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MCS
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SV40polyA质粒。
[0011]优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信号；所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、泛素UBC启动子或延长因子EF1α启动子。
[0012]本专利技术采用的polyA加尾信号可以为bpA、SV40等加尾信号之一，SV40加尾信号只是本专利技术构建的PPAP序列中的更优选polyA加尾信号，本专利技术可以根据表达宿主细胞的不同、PPAP序列插入的微环DNA空质粒的不同等条件选择不同的polyA加尾信号构建PPAP序列。
[0013]本专利技术采用的启动子可以为CMV、RSV、UBC和EF1α等真核表达启动子之一，CMV启动子只是本专利技术构建的PPAP序列中的更优选启动子，本专利技术可以根据表达宿主细胞的不同、PPAP序列插入的微环DNA空质粒的不同等条件选择不同的启动子构建PPAP序列。
[0014]更优选地，所述polyA加尾信号为SV40加尾信号，所述SV40加尾信号核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子，所述巨细胞病毒CMV启动子核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
[0015]当所述polyA加尾信号为SV40加尾信号、所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子时，所述PPAP序列的完整核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016]根据本专利技术第二方面，本专利技术提供如下技术方案：
[0017]一种上述的基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体的构建方法，包括如下步骤：
[0018](1)采用全基因序列合成的方式合成DNA片段，该DNA片段包括依次连接的BstBI酶
切位点、所述PPAP序列和BamHI酶切位点；
[0019](2)采用BstBI内切酶和BamHI内切酶对步骤(1)所得的DNA片段进行双酶切，并回收酶切后的含所述PPAP序列的DNA片段；
[0020](3)采用BstBI内切酶和BamHI内切酶对所述微环DNA质粒进行双酶切，并回收酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体，其特征在于，所述微环DNA表达载体由目的基因、PPAP序列和微环DNA质粒构成，通过在所述微环DNA质粒的多克隆位点插入所述PPAP序列和目的基因形成重组母质粒，再将所述重组母质粒在工程菌内发生分子内位点特异性重组而形成所述微环DNA表达载体，其中所述PPAP序列包括依次连接的polyA加尾信号、启动子、反向attB序列、ΦC31整合酶基因和终止密码子，所述反向attB序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的ΦC31整合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述终止密码子的核苷酸序列为TGA，所述目的基因为需要整合入宿主细胞染色体的外源基因片段。2.如权利要求1所述的一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体，其特征在于，所述微环DNA质粒为pMC.CMV
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MCS
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SV40polyA质粒或pMC.EF1α
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MCS
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SV40polyA质粒。3.如权利要求1所述的一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体，其特征在于，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信号；所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、泛素UBC启动子或延长因子EF1α启动子。4.如权利要求3所述的一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体，其特征在于，所述polyA加尾信号为SV40加尾信号，所述SV40加尾信号核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子，所述巨细胞病毒CMV启动子核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。5.如权利要求4所述的一种基于假attP位点自发定向整合的通用型微环DNA表达载体，其特征在于，所述PPAP序列的完整核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐祥，敖翔，敖罗权，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：