一种筛选基因编辑弓形虫的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选基因编辑弓形虫的方法，属于基因编辑技术领域。本发明专利技术的目的在于弥补现有技术获得阳性虫体成功率低的不足，提供一种使用昆明鼠作为电转质粒后弓形虫的宿主进行筛选，与以往用HFF细胞作为筛选宿主相比，昆明鼠腹腔液内含有虫体生长繁殖的营养物质，有利于经电转成功的少量虫体生存下来，增加获得电转虫体的成功率，克服以往用HFF细胞作为基因编辑弓形虫的宿主因营养物质缺乏而致筛选失败的不足。本方法所用时间短，得到的阳性弓形虫数量充足，活性高，易满足后续实验需求。验需求。验需求。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选基因编辑弓形虫的方法


[0001]本专利技术属于基因编辑
，尤其涉及一种筛选基因编辑弓形虫的方法。

技术介绍

[0002]刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，T.gondii)广泛寄生于人和多种动物有核细胞内，是一种重要的人兽共患机会致病原虫，慢性感染世界近三分之一的人口。根据虫体的侵袭力、繁殖速度及对宿主的致死率等，刚地弓形虫可分为强毒(Ⅰ型)和弱毒(Ⅱ型)和野生动物(Ⅲ型)株系以及非典型株系(与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ典型虫株不同)，国际上公认的强毒株代表为RH株。作为一种机会性致病原虫，健康人感染弓形虫常表现为隐性感染，但免疫抑制患者(如器官移植、应用免疫抑制剂、长期接受放疗的肿瘤患者)以及先天性和后天性免疫缺陷者(艾滋病患者)，弓形虫感染可引起严重的疾病，甚至死亡。弓形虫随血液流动到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使人的免疫力下降，患各种疾病。此外，孕妇感染弓形虫，可通过胎盘传给胎儿，导致流产、死胎或畸形，已将弓形虫列为孕前筛查项目。近几年，随着家养宠物的不断增多，外加二胎政策的实施，弓形虫病的发生率大幅上升，因而日益受到政府相关部门及该领域科研工作者的高度关注。
[0003]自弓形虫被发现一百多年来，弓形虫对人体致病机制的研究尚不完善，还有很多问题需要我们去深入的探索和研究，因此弓形虫的毒力因子或其他致病因子的研究就显得十分重要。为了更好的探索弓形虫的致病机制，针对弓形虫致病相关蛋白的基因进行基因编辑是一项重要的研究手段。但是由于弓形虫虫体只有4～7μm，远小于细胞的大小，因此现今常用的细胞转染质粒的方法和试剂不适用于弓形虫。目前比较常用的弓形虫的质粒转染方法为电穿孔转染法，但是该方法由高压脉冲引起的大量虫体死亡和仅部分成功的膜修复，从而造成获得的阳性虫体数往往很少。而接下来的筛选过程中，以往是在HFF细胞系中进行，但是由于体外培养体系中的营养成分相对单一且不够丰富，对阳性弓形虫在细胞内生存下来非常困难。且筛选过程一般需要2
‑
4周，耗时长，易污染，操作复杂，所获得阳性弓形虫的成功率极低。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于：为了解决目前比较常用的弓形虫的质粒转染方法为电穿孔转染法，但是该方法由高压脉冲引起的大量虫体死亡和仅部分成功的膜修复，从而造成获得的阳性虫体数往往很少。而电转后阳性虫体的筛选，传统的方法是在HFF细胞系中进行，但是由于体外HFF细胞培养体系中的营养成分相对单一且不够丰富，电转后的阳性弓形虫在细胞内生存下来非常困难，往往导致失败。且筛选过程一般需要2
‑
4周，耗时长，易污染，操作复杂，所获得阳性弓形虫的成功率极低的问题，而提出的一种筛选基因编辑弓形虫的方法。
[0005]为了解决以上的问题，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种筛选基因编辑弓形虫的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
[0007]S1、弓形虫的准备：取对数生长期的弓形虫RH株速殖子，进行离心，弃上清，用Cytomix/ATP/GSH混合液重悬速殖子，将速殖子的浓度调整为3.3
×
107/mL；
[0008]S2、质粒的准备：在超净工作台中，用100μL Cytomix/ATP/GSH混合液重悬10μg质粒DNA；
[0009]S3、电转：将300μL(107)速殖子悬液加入到准备好的质粒溶液中，混匀后转移至2mm的已灭菌的电击杯中，进行电穿孔，电击一次，电击后静置5
‑
10min；
[0010]S4、阳性虫体的筛选：将电转后的速殖子全部接种于准备好的洁净级的昆明鼠腹腔内，24h后每只小鼠腹腔注射乙胺嘧啶，随后每天注射一次，2
‑
4天后小鼠出现皮毛暗淡粗糙、行动迟缓等症状后处死小鼠，收集腹腔液，分离4000rmp离心10min分离速殖子，计数后接种小鼠，接种量为2
×
106/只，液体体积为200μL，并同时注射乙胺嘧啶，继续筛选5代以上，收集速殖子；
[0011]S5、检测：将收集到的筛选后的速殖子提取总DNA，按照设计好的引物进行鉴定质粒转染情况，从而判断是否成功获得了基因编辑的弓形虫。
[0012]作为上述技术方案的进一步描述：
[0013]所述S4中，电转后的速殖子接种于洁净级的昆明鼠腹腔内。
[0014]作为上述技术方案的进一步描述：
[0015]所述S4中，弓形虫传代接种量为2
×
106/只，液体体积为200μL。
[0016]作为上述技术方案的进一步描述：
[0017]所述S4中，乙胺嘧啶的注射剂量为200μL，浓度为2mg/kg。
[0018]综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
[0019]1、本专利技术的目的在于弥补现有技术获得阳性虫体成功率低的不足，提供一种使用昆明鼠作为电转质粒后弓形虫的宿主进行筛选，与以往用HFF细胞作为筛选宿主相比，昆明鼠腹腔液内含有虫体生长繁殖的营养物质，有利于经电转成功的少量虫体生存下来，增加获得电转虫体的成功率，克服以往用HFF细胞作为基因编辑弓形虫的宿主因营养物质缺乏而致筛选失败的不足。本方法所用时间短，得到的阳性弓形虫数量充足，活性高，易满足后续实验需求。
[0020]2、本专利技术所用的电转质粒含有乙胺嘧啶抗性基因，因此，电转及每次转种后的虫体注射昆明鼠腹腔的同时使用浓度为2mg/kg/天的乙胺嘧啶200μL进行阳性虫株的筛选，以获得纯的基因编辑弓形虫。
附图说明
[0021]图1为本专利技术提出的一种筛选基因编辑弓形虫的方法中实施例1的ROP18基因过表达弓形虫虫株PCR鉴定示意图；
[0022]图2为本专利技术提出的一种筛选基因编辑弓形虫的方法中实施例2的ROP16基因敲除弓形虫虫株PCR鉴定示意图；
[0023]图3为本专利技术提出的一种筛选基因编辑弓形虫的方法中实施例2的ROP16基因敲除鉴定引物设计模式图；
[0024]图4为本专利技术提出的一种筛选基因编辑弓形虫的方法中实施例3的ROP16基因敲除弓形虫虫株PCR鉴定示意图；
[0025]图5为本专利技术提出的一种筛选基因编辑弓形虫的方法中实施例3的ROP16基因敲除鉴定引物设计模式图。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]实施例1
[0028]本专利技术提供一种技术方案：
[0029]一种筛选基因编辑弓形虫的方法，具体包括以下步骤：
[0030]S1、弓形虫的准备：取对数生长期的弓形虫RH株速殖子，4000rmp离心10min，弃上清，用Cytomix/ATP/GSH混合液重悬速殖子，将速殖子的浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选基因编辑弓形虫的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、弓形虫的准备：取对数生长期的弓形虫RH株速殖子，进行离心，弃上清，用Cytomix/ATP/GSH混合液重悬速殖子，将速殖子的浓度调整为3.3
×
107/mL；S2、质粒的准备：在超净工作台中，用100μL Cytomix/ATP/GSH混合液重悬10μg质粒DNA；S3、电转：将300μL(107)速殖子悬液加入到准备好的质粒溶液中，混匀后转移至2mm的已灭菌的电击杯中，进行电穿孔，电击一次，电击后静置5
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10min；S4、筛选：将电转后的速殖子全部接种于准备好的洁净级的昆明鼠腹腔内，24h后每只小鼠腹腔注射乙胺嘧啶，随后每天注射一次，2
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4天后小鼠出现皮毛暗淡粗糙、行动迟缓等症状后处死小鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡雪梅，王超，刘现兵，李志丹，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：