用于在酵母中高表达蛋白质的重组载体制造技术

本发明专利技术涉及用于高蛋白质表达的重组载体。更特别地，本发明专利技术涉及具有启动子序列和终止子序列的重组载体，用于同源和异源蛋白质的组成型表达，其中启动子序列选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成的组以及终止子序列具有选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的序列。NO:4组成的组的序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在酵母中高表达蛋白质的重组载体


[0001]本专利技术涉及用于在酵母中高表达蛋白质的重组载体。具体而言，本专利技术涉及用于工业和治疗用途的用于同源和异源蛋白质的组成型表达的具有启动子序列和终止子序列的载体。
[0002]
技术介绍
和相关技术的描述
[0003]马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是酵母目(Saccharomycetales)酵母的成员。马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)具有工业用途所需的各种理想特性，例如在任何真核生物中最快的生长速度(倍增时间约为70分钟)，耐热性(能够生长至52℃)，高分泌能力和同化糖类(诸如葡萄糖、木糖、乳糖和菊粉)的能力。这些显著的特性使该菌株成为各种常见工业生物技术应用的最佳选择之一，例如酶的生产和酒精发酵(Nonklang等人,2008),(Fonseca等人,2008)。马克斯克鲁维酵母在高温下生长的能力对发酵工业具有特别高的价值，因为它降低了冷却成本以及潜在的污染风险。
[0004]已经尝试从各种酵母菌株中表达异源蛋白质并分离小分子，例如乳酸和木糖醇(Bae等人，2017；Kim等人，2015；Zhang等人，2015；Zhang等人，2014)。
[0005]为了在马克斯克鲁维酵母中表达异源蛋白，许多研究采用了源自酿酒酵母(S.cerevisiae)的启动子，例如半乳糖激酶(GAL1)(Almeida等人,2003)、甘油醛
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脱氢酶(TDH3)(Nonklang等人,2009)和3
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磷酸甘油酸酯激酶(PGK1)(Ball等人，1999；Pecota等人，2007)。在这些启动子中，GAL1启动子是半乳糖可调节的，其他如TDH3和PGK是组成型表达的。TDH3和PGK是已尝试用于蛋白质表达的马克斯克鲁维酵母起源的强启动子。(Yang等人，2015年)。
[0006]启动子强度(ADH1、TDH3和PGK)的比较研究表明，马克斯克鲁维酵母的天然启动子比酿酒酵母的相应启动子更强(Yang等人,2015)，这为进一步探索马克斯克鲁维酵母的天然启动子奠定了基础。
[0007]菊粉酶启动子(INU1)和GAL1是马克斯克鲁维酵母起源的强启动子，但启动子强度取决于碳源，并且在高葡萄糖浓度下会下调(Bergkamp等人，1993，Gao等人，2015，Liu等人，2013,Akada等人，2014美国专利8,846,343)。总体而言，只有有限数量的启动子可用于将马克斯克鲁维酵母用作蛋白质表达的宿主菌株，因此迫切需要鉴定比目前已知的强度更高的新启动子。
[0008]对于异源蛋白的高表达，终止子在增加mRNA半衰期和改善基因表达方面发挥重要作用(Curran等人，2013)，但在马克斯克鲁维酵母中，表达载体中使用的大多数终止子是来自酿酒酵母的CYC。因此，还需要鉴定比目前已知的新的强终止子。
[0009]在本专利技术中，使用具有和不具有天然终止子的各种启动子，详细研究在酵母中具有高蛋白质表达的载体。本专利技术提供了新的启动子和终止子，其在迄今为止未知的用于马克斯克鲁维酵母的任何其他表达载体中强度最高。本专利技术可用于有效且经济地生产同源和异源蛋白质。
[0010]本专利技术的目的
[0011]综上所述，本专利技术的首要目的是提供一种在酵母中高表达蛋白质的重组载体，其启动子和终止子均从马克斯克鲁维酵母中鉴定，用于高表达同源和异源蛋白质。
[0012]本专利技术的另一个目的是开发具有来自马克斯克鲁维酵母的启动子和终止子的组合的载体，用于使用具有不同碳源例如葡萄糖(dextrose)和木糖的生长培养基来高表达同源和异源蛋白质。
[0013]然而，本专利技术的另一个目的是开发组成型高表达启动子，而不需要额外的分子来诱导蛋白质表达。

技术实现思路

[0014]本文提供了用于高蛋白表达的重组载体。在本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种具有启动子序列和终止子序列的重组载体，用于同源和异源蛋白质的组成型表达，其中启动子序列选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成的组以及终止子序列具有选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的序列。
[0015]在本专利技术的一方面，本专利技术提供的启动子序列包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％同源性的序列。
[0016]在本专利技术的又一方面，本专利技术提供了用于在马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母中表达蛋白质的载体。
[0017]在本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了一种表达载体，其编码在其5'端连接到编码eGFP或荧光素酶的DNA。在本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了一种编码终止子的表达载体，该终止子与编码eGFP或荧光素酶的DNA在其5'端连接。
[0018]在本专利技术的又一方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，其包含用于在20℃至45℃的温度下在马克斯克鲁维酵母和其他酵母细胞中表达同源和异源基因的表达载体。
[0019]附图的简要说明
[0020]图1是用于克隆的质粒构建体和限制性位点的示意图。用于启动子的限制性位点是SacI和XbaI。用于终止子的限制性位点是XhoI和KpnI。使用限制性位点BamHI和XhoI克隆编码所需蛋白质的基因。
[0021]图2表示新载体pKMDSH1(MTCC 25226)，编码IMTCP1启动子和IMTT1终止子的图谱。启动子被亚克隆在载体的限制性内切核酸酶位点Sac1和Xba1之间。终止子被亚克隆在载体的限制性位点XhoI和Kpn1之间。FLuc基因被亚克隆在限制性位点BamHI和XhoI之间。
[0022]图3表示新载体pKMDSH2(MTCC 25227)，编码IMTCP1启动子和IMTT2终止子的图谱。启动子被亚克隆在载体的限制性内切核酸酶位点Sac1和Xba1之间。终止子被亚克隆在载体的限制性位点XhoI和Kpn1之间。FLuc基因被亚克隆在限制性位点BamHI和XhoI之间。
[0023]图4表示新载体pKMDSH3(MTCC 25228)，编码IMTCP2启动子和IMTT1终止子的图谱。启动子被亚克隆在载体的限制性内切核酸酶位点Sac1和Xba1之间。终止子被亚克隆在载体的限制性位点XhoI和Kpn1之间。FLuc基因被亚克隆在限制性位点BamHI和XhoI之间。
[0024]图5表示新载体pKMDSH4(MTCC 25229)，编码IMTCP2启动子和IMTT2终止子的图谱。启动子被亚克隆在载体的限制性内切核酸酶位点Sac1和Xba1之间。终止子被亚克隆在载体的限制性位点XhoI和Kpn1之间。FLuc基因被亚克隆在限制性位点BamHI和XhoI之间。
[0025]图6表示在马克斯克鲁维酵母中不同启动子控制下的GFP的表达水平。含有在指定
启动子控制下编码eGFP的质粒的马克斯克鲁维酵母菌株在以葡萄糖作为碳源的合成培养基中在30℃和45℃下生长，或在以木糖作为碳源的合成培养基中在3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.具有启动子序列和终止子序列的重组载体，其用于同源和异源蛋白质的组成型表达，其中所述启动子序列选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成的组以及所述终止子序列具有选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的序列。2.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述启动子序列包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％同源性的序列。3.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述终止子序列包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：迪帕克，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：