一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第226位或第242位进行突变获得。本发明专利技术筛选得到一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，增强了突变酶在70℃下的半衰期，提高了酶对合成乳果糖所用底物乳糖的底物亲和力和转化效率。运用含有改造酶的基因工程菌进行生物转化，产物乳果糖得率显著增加，副产物依匹乳糖得率明显降低。本发明专利技术展示了纤维二糖差向异构酶在合成乳果糖绿色环保、毒性低，副产物少和产物得率高的技术优势，经过分子改造获得的纤维二糖差向异构酶突变体具有重要的工业应用前景。具有重要的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，及其在微生物催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用。

技术介绍

[0002]乳果糖是由D
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半乳糖和D
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果糖两个基团通过β
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1,4糖苷键连接而成的还原型二糖；乳果糖口服液具有治疗慢性便秘和肝性脑病的功效，需求量巨大；乳果糖还可以作为益生元改善人体肠道菌群关系。乳果糖的生产依赖化学法，其催化剂对人体有害，下游分离难度大。近年来，纤维二糖差向异构酶被发现能够高效催化乳糖制备乳果糖，该技术绿色环保、步骤简单，具有很强的产业化前景。
[0003]生物转化是一种利用微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂，将底物转化为产物的过程。生物转化具有反应条件温和、原料利用率高的特点，同时转化过程具有优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性，能够保证目标化合物的高效合成。目前，利用异构酶或含有该酶的细胞为生物催化剂进行异构化反应制备多种糖类化合物，已成为制糖工业重要的经济增长点。
[0004]纤维二糖差向异构酶(cellobiose 2
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epimerase，EC 5.1.3.11，简称CE)属于N
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乙酰
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D
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氨基葡萄糖2
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差向异构酶(AGE)家族成员，可催化乳糖的D
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葡萄糖醛酮异构化生成乳果糖。CE酶中使用最多的是来源于嗜热微生物Caldicellulosiruptorsaccharolyticus的纤维二糖差向异构酶(简称CsCE)，该酶的研究报道近来很多，使用最为广泛；此外还有来源于Dictyoglomus turgidum、Caldicellulosiruptor obsidiansis、 Dictyoglomus thermophilum的CE也适合生产乳果糖。
[0005]尽管CE催化乳糖的效率较高，但仍然存在诸多问题：首先温度影响异构化反应过程中乳果糖得率，根据热力学反应平衡原理，CE反应体系必须能够长时间耐受高温才能生成高浓度乳果糖；其次是反应副产物依匹乳糖的占比问题，尽管依匹乳糖本身也是一种人体益生元，但各国药典对其含量均有严格限制，因此合成乳果糖的反应中依匹乳糖含量越低越好。
[0006]运用蛋白质工程技术开展酶分子改造，能通过分子手段极大限度地提高天然酶的催化性能，本专利技术通过开发新型CE，对其实施分子改造，获得高效制备乳果糖的生物催化剂，对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、编码基因、工程菌及其在微生物催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用，为乳果糖制备工艺提供一种绿色环保、卫生安全的生物制备方法。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：
[0009]本专利技术提供一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，所述突变体是将SEQ ID
NO.1所示氨基酸序列第226位或第242位进行突变获得的；优选将第226位天冬氨酸突变为甘氨酸(D226G)，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；或第242位丙氨酸突变为缬氨酸(A242V)，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0010]本专利技术还涉及一种所述耐高温纤维二糖差向异构酶突变体的编码基因，包含所述编码基因的重组载体，以及包含所述重组载体的重组基因工程菌；所述重组载体以 pET28b为载体，插入位点Xba I和Xho I，所述重组基因工程菌以E.coli BL21(DE3) 为宿主菌。
[0011]本专利技术还提供一种所述耐高温纤维二糖差向异构酶突变体在催化乳糖制备乳果糖中的应用，所述的应用为：以含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)/CmCE/D226G)经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶作为生物催化剂，以乳糖为底物，以pH 6
‑
8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在50
‑
80℃、100
‑
200r/min条件下反应，反应完全后，反应液分离纯化，获得乳果糖。
[0012]优选所述的反应体系中，乳糖加入终浓度为50
‑
150g/L，优选100g/L；催化剂以湿菌体形式加入的量为40
‑
60g/L，优选50g/L；催化剂以纯酶形式加入的量以蛋白浓度计为0.4
‑
0.6mg/mL，优选0.5mg/mL。优选反应介质为pH 7.5、50mM的HEPES 缓冲液；反应条件优选为70℃、150r/min。
[0013]优选，所述湿菌体按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌划线至LB固体培养基，37℃倒置培养12h，接种于含终浓度50μg/mL 卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养8h；培养液以2％(v/v)转接量转接至含终浓度50μg/mL的卡那霉素抗性的LB培养基中，在37℃，150r/min的条件下培养OD
600
＝0.6
‑
0.8，添加终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，在28℃，150r/min条件下，诱导发酵12h，离心弃上清液，收集湿菌体。
[0014]优选，所述纯酶按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌诱导培养的湿菌体按1g湿菌体用20mL的50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液重悬，在50W条件下超声破碎30min，期间工作1s、间隔2s，破碎混合液在 8000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液，作为上样液；采用nickel
‑
NTA亲和层析柱(Bio
‑
Scale Mini Profinity IMAC预装柱，40mm长
×
12.6mm内径)进行纯化，先用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，上样液以1mL/min的速度上样4个柱体积，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)以1mL/min的速度进行洗脱，根据紫外检测器和电导率检测器的信号响应，当紫外检测器的信号和电导率检测器信号同时上升时收集相应的洗脱液，当电导率检测器信号不变且紫外检测器的信号下降时停止收集，即为纯酶。
[0015]优选的，所述反应液分离纯化制备乳果糖的方法为：反应液10000rpm离心10min 后，取上清液，再以1.5mL/min的速率通过DOWEX MONOSPHERE 77阴离子交换树脂柱和DOWEX MONOSPHERE 88阳离子交换树脂柱洗脱盐离子，待溶液电导响应值趋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第226位或第242位进行突变获得的。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将第226位天冬氨酸突变为甘氨酸或第242位丙氨酸突变为缬氨酸。3.一种权利要求1所述耐高温纤维二糖差向异构酶突变体的编码基因。4.一种包含权利要求3所述编码基因的重组基因工程菌。5.一种权利要求1所述耐高温纤维二糖差向异构酶突变体在催化乳糖制备乳果糖中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶作为生物催化剂，以乳糖为底物，以pH 6
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8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在50
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80℃、100
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200r/min条件下反应，反应完全后，反应液分离纯化，获得乳果糖。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的反应体系中，乳糖加入终浓度为50
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150g/L；催化剂以湿菌体形式加入的量为40
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60g/L；催化剂以纯酶形式加入的量以蛋白含量计为0.4
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0.6mg/L。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应介质为pH 7.5、50mM的HEPES缓冲液。9.如权利要求6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，贾东旭，王番，余海，金利群，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：