燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及三萜的生物合成，具体涉及燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2及其编码基因与应用。所述氧化鲨烯环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术首次发现并克隆了燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2，并通过烟草体外瞬时表达、GC

【技术实现步骤摘要】
燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2及其编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及三萜的生物合成，具体涉及燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2及其编码基因与应用。

技术介绍

[0002]三萜类化合物是天然产物中种类最多的一类，迄今为止，已经发现超过20000种，主要分布在植物中，其中双子叶植物三萜化合物的分布较为丰富，动物和微生物中也有分布，如在海洋动物海参和海星中发现了三萜类化合物的存在，在真菌灵芝中发现150余种灵芝三萜，细菌中可以催化鲨烯(squalene)合成三萜何伯烯(hopane)。
[0003]三萜类化合物具有重要的生物学活性和药用价值，早已广泛应用于食品、工业和医药等各个领域。2,3
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氧化鲨烯是三萜苷元合成的直接前体，催化这一三萜合成的关键步骤的2，3
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氧化鲨烯环化酶(OSC)又称三萜合酶。三萜骨架的多样性是由于植物中三萜合酶的多样性。目前有超过170种来源于植物的氧化鲨烯环化酶的功能得到验证，其中大多数是利用酵母菌株异源表达鉴定的。这些氧化鲨烯环化酶中大约三分之一为甾醇合酶(sterol synthase)，包括环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase，CAS)和羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase，LAS)。催化三萜合成的氧化鲨烯环化酶有β
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香树脂醇合酶(β
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amyrin synthase，bAS)、羽扇豆醇合酶(Lupeol synthase，LUS)、达玛二烯醇合成酶(dammarenediol synthase，DS)等，其中常见的为β
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香树脂醇合酶和羽扇豆醇合酶(Thimmappa et al.,2014)。
[0004]近年来，随着基因组测序的快速发展，一些植物的全基因组序列已经发表出来，很多OSC基因已经被克隆出来。双子叶植物的OSC已经被广泛研究，但是鲜有发现具有新颖功能的OSC酶。对禾本科单子叶植物水稻和高粱中的OSC进行功能分析，分别发现了几种前所未有的三萜合酶，如异乔木萜醇酶、fernenol合酶和simiarenol合酶(Busta et al.,2021)。挖掘具有新颖功能的OSC酶将有助于深入解析三萜生物合成途径，为三萜类化合物的生物合成奠定基础。

技术实现思路

[0005]基于上述领域的研究现状，我们推测从单子叶植物中更有可能挖掘到具有新颖功能的OSC酶。本专利技术通过对燕麦转录组数据进行分析，从燕麦中发现并克隆了燕麦氧化鲨烯环化酶基因AsHS2，利用Gateway技术构建了AsHS2烟草异源表达载体并进行烟草瞬时表达，通过GC
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MS比较转基因烟草和对照烟草的提取物，找到了差异化合物，并通过核磁共振技术鉴定为17(21)
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烯何伯醇(hop
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(17)21
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en
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3β
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ol)，该化合物即燕麦氧化鲨烯环化酶AsHS2的产物。
[0006]本专利技术提供的氧化鲨烯环化酶AsHS2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]所述氧化鲨烯环化酶AsHS2的编码基因也属于本专利技术的保护范围。
[0008]所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]含有权利要求2或3所述的基因的表达盒、载体和重组菌也属于本专利技术的保护范围。
[0010]本专利技术还提供一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述的基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物中化合物hop
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(17)21
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en
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3β
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ol的含量发生改变。
[0011]优选地，所述基因是通过重组表达载体导入出发植物中的；所述重组表达载体是将所述基因插入出发载体pEAQ
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HT
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DEST1中得到的；所述出发植物为对照烟草；所述转基因植物为转基因烟草。
[0012]所述转基因烟草与所述对照烟草相比，产生了化合物hop
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(17)21
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en
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3β
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ol。
[0013]所述氧化鲨烯环化酶AsHS2或所述基因在hop
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(17)21
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en
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3β
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ol生物合成中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0014]本专利技术首次克隆了燕麦氧化鲨烯环化酶基因AsHS2并验证了其功能，为深入解析17(21)
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烯何伯醇(hop
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(17)21
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en
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3β
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ol)的生物合成途径奠定了基础。
附图说明
[0015]图1.琼脂糖凝胶回收AsHS2基因的电泳图片。
[0016]图2.烟草表达产物GC
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MS的总离子流色谱图(TIC)以及提取色谱谱图(EIC 455.4)；图中数字1指示AsHS2转基因烟草产生的差异化合物(与对照烟草相比)，称作化合物1。tHMGR表示转入了pEAQ
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HT
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DEST1
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tHMGR载体的对照烟草叶片样品；tHMGR
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AsHS2表示转入了pEAQ
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HT
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DEST1
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tHMGR和pEAQ
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HT
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DEST1
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AsHS2表达载体的AsHS2转基因烟草叶片样品，每个样品三次重复。
[0017]图3.化合物1的TMS衍生物的质谱图。
[0018]图4.化合物1的碳谱。
[0019]图5.化合物1的氢谱。
[0020]图6.化合物1的结构。
具体实施方式
[0021]下面结合具体实施例对本专利技术进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本专利技术的解释和说明，不以任何形式限制本专利技术的范围。
[0022]生物材料
[0023]植物：以下实施例中使用的燕麦(Avena strigosa)品种为S75。以下实施例中使用的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)种子来自实验室保存，该材料已在Ting H,et al.SNARE
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RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.Molecular Plant.2015；8:454
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466中公开。烟草瞬时表达实验中使用的是6周龄的烟草植株。
[0024]菌株：大肠杆菌Trelief...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氧化鲨烯环化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述的氧化鲨烯环化酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.含有权利要求2或3所述的基因的表达盒。5.含有权利要求2或3所述的基因的载体。6.含有权利要求2或3所述的基因的重组菌。7.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述的基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物中化合物hop
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ol的含量发生改变。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述基因是通过重组表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛哲勇，梁苗苗，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：