一种可表达人源IgA1蛋白的鼠模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种可表达人源IgA1蛋白的小鼠模型，它是将人源IGHA1的基因序列整体导入小鼠Igha基因区域、用人源IgA1的重链区替代小鼠IgA的重链区，从而表达带有O糖修饰的铰链区的人源IgA1的小鼠；所述的人源IgA1的基因序列整体是指人源IGHA1基因的全段，包含外显子和内含子。本发明专利技术所述的小鼠模型不仅能有效表达人源IgA1蛋白，还尽可能地保留了IgA1抗体的基因信息，能够实现人鼠杂合IgA1抗体的完整性，保证小鼠体内人源IgA1分子的功能性，比现有常规的构建方法更加具有特异性，并更接近人IgA1的天然性状。本发明专利技术还提供了构建所述小鼠模型的方法，及所述小鼠模型在IgA肾病相关领域的应用。应用。

【技术实现步骤摘要】
一种可表达人源IgA1蛋白的鼠模型及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及人源化小鼠模型，尤其涉及人源化可表达人源IgA1蛋白的小鼠模型及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)是目前全球最常见的原发性肾小球疾病。根据来自于中国、韩国及日本的临床数据，在亚洲人群中，IgA肾病约占所有肾小球疾病的30
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40％。而在北欧和美国人群统计中，IgA肾病约占所有肾小球疾病的25
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30％。其中超过30％的患者会在发病10
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20年后进展至终末期肾脏病(End
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Stage Renal Disease,ESRD)，使得IgA肾病成为引起青壮年尿毒症最常见的病因之一。
[0003]人源化抗体小鼠是开发全人源化抗体药物的核心工具动物，在IgA肾病的发病机制和IgA肾病模型研究、以及人源IgA1抗体的发展和效价验证领域都具有很高的推广应用价值。
[0004]现有技术中，IgA1小鼠的构建过程通常基于ES同源重组技术，且将IGHA1基因替换了小鼠原有的IgM重链区域，有免疫代偿机制，不能完全表现人源IgA1的生理功能。例如，Duchez等的工作(Duchez,S.,et al.(2010)."Premature replacement of mu with alpha immunoglobulin chains impairs lymphopoiesis and mucosal homing but promotes plasma cell maturation."Proc Natl Acad Sci U S A 107(7):3064
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3069.)证明替代了IgM的IgA1蛋白主要表达在脾脏而非粘膜淋巴器官，IgM成熟后再向粘膜募集，这与人IgA1的主要分布在粘膜系统进行天然免疫的生理功能相悖，未获得完整意义上的人源IgA1小鼠。
[0005]因此有必要通过新的构建方法提供一种可表达人源IgA1蛋白的小鼠模型，用于IgA肾和相关药物的研究。

技术实现思路

[0006]鉴于上述背景，本专利技术提出的目的首先在于：提供一种小鼠模型，不仅能够有效表达重链为全人源IgA1的免疫球蛋白，并且还能够实现人鼠杂合IgA1抗体的生理完整性，保证小鼠体内人源IgA1分子的功能性，进而更接近人IgA1的天然性状。
[0007]本专利技术的目的还在于：提供构建所述鼠模型的方法，以及所述鼠模型在IgA肾病相关领域的应用。
[0008]本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：
[0009]首先，本专利技术第一个方面提供一种可表达人源IgA1蛋白的小鼠模型，它是将人源IGHA1的基因序列整体导入小鼠Igha基因区域、进而用人源IgA1的重链区替代小鼠IgA的重链区，从而表达带有O糖修饰的铰链区的人源IgA1的小鼠；所述的人源IgA1的序列整体是指人源IGHA1基因的全段，包含外显子和内含子。
[0010]本专利技术优选的小鼠模型方案中，导入所述小鼠Igha基因区域的人源IGHA1的序列，
其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]本专利技术优选的小鼠模型方案中，所述的导入是通过基因敲入的方式完成；进一步优选采用基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因敲入完成，由此可以将人源IGHA1基因定点敲入小鼠Igha基因部分，以尽可能保证所得的鼠模型在人源IgA1的同表达谱表达的同时，还会保持小鼠其它免疫球蛋白的稳定性和天然表达水平，更贴近IgA1的粘膜抗体的生理功能。
[0012]在此基础上，本专利技术第二个方面提供一种构建所述可表达人源IgA1蛋白的小鼠模型的方法，是采用基因定点敲入的方式，选择人源IGHA1基因组全序列作为敲入序列，以鼠Igha基因序列作为目标替换序列，将人源IGHA1基因组全序列导入小鼠基因，经过常规鉴定、繁育得到可表达人源IgA1蛋白的小鼠；所述的人源IGHA1基因组全序列中包含外显子和内含子。
[0013]本专利技术优选的所述构建方法，具体包括：
[0014]1.利用Cas9/RNA系统基因编辑技术，构建针对小鼠Igha基因的gRNA，用于指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切DNA双链，得到Cas9打靶载体；
[0015]2.制作供体载体(Donor vector)，使Donor vector携带靶位点同源臂及敲入元件，所述的敲入元件为人源IGHA1基因组全序列；将所述Donor vector与步骤1得到的Cas9打靶载体共同进行受精卵注射，Cas9打靶载体切开小鼠Igha基因的上游一号外显子和下游4号外显子，产生一个双链断点，将人源IGHA1基因组全序列通过同源重组的方式修饰入小鼠的Igha基因位点；
[0016]3.将步骤2所得的注射后受精卵通过移植、代孕得到小鼠；
[0017]4.通过基因鉴定和可遗传性检测从步骤3得到的小鼠中筛选出合格的杂合子小鼠，即为可表达人源IgA1蛋白的小鼠模型。
[0018]本专利技术优选的所述构建方法中，因为转入基因较大，步骤2所述的受精卵注射采用大量多次注射，优选进行至少两批次注射，每批次注射至少500枚胚胎，以保证阳性鼠的成功构建。
[0019]本专利技术优选的所述构建方法中，步骤2所述注射用的受精卵为C57BL/6JNju背景。
[0020]本专利技术优选的所述构建方法中，步骤4所述的基因鉴定包括PCR测序和插入序列的全长测序，可以进一步保证每一只向下繁育和留存精子的杂合子小鼠均具有完整且正确的插入序列。
[0021]此外，本专利技术第三个方面提供所述可表达人源IgA1蛋白的小鼠模型作为实验材料在IgA肾病的预防、诊断或治疗相关研究中的应用。
[0022]所述的IgA肾病的预防、诊断或治疗相关研究优选包括以下任意一种研究：
[0023]人源IgA1与肠道菌群相关的粘膜免疫过程的研究；
[0024]IgA肾病的发病机制和IgA肾病模型的研究；
[0025]人源IgA1抗体的发展和效价验证；
[0026]IgA1的O糖基化或N糖基化水平受粘膜免疫刺激的影响的研究；
[0027]人鼠杂合的IgA1分子的免疫组库在不同刺激条件下的多样性的研究；
[0028]或者，
[0029]IgA1分子在循环、肠道、脾脏的免疫复合物成分分析研究。
[0030]现有技术中，通常将人源IGHA1基因外显子筛选出来敲进小鼠体内，或通过同源重组技术将人源IGHA1基因插入小鼠的Ighm基因。而本专利技术将人源IGHA1基因组的全序列(包含外显子和内含子)同时通过Cas9/RNA系统基因编辑技术定点替换小鼠体内Igha基因。将所述人源IGHA1基因组的全序列整体敲入后，在可以获得IgA1分子铰链区表达的同时还尽可能地保留了IgA1抗体的基因信息，能够实现人鼠杂合IgA1抗体的完整性，保证小鼠体内人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可表达人源IgA1蛋白的小鼠模型，它是将人源IGHA1的基因序列整体导入小鼠Igha基因区域、用人源IgA1的重链区替代小鼠IgA的重链区，从而表达带有O糖修饰的铰链区的人源IgA1的小鼠；所述的人源IgA1的基因序列整体是指人源IGHA1基因的全段，包含外显子和内含子。2.权利要求1所述的小鼠模型，其特征在于：导入所述小鼠Igha基因区域的人源IgA1的序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.权利要求1或2任意一项所述的小鼠模型，其特征在于：所述的导入是通过基因敲入的方式完成；进一步优选采用基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因敲入完成。4.一种构建可表达人源IgA1蛋白的小鼠模型的方法，是采用基因定点敲入的方式，选择人源IGHA1基因组全序列作为敲入序列，以鼠Igha基因序列作为目标替换序列，将人源IGHA1基因组全序列导入小鼠基因，经过常规鉴定、繁育得到可表达人源IgA1蛋白的小鼠；所述的人源IGHA1基因组全序列中包含外显子和内含子。5.权利要求4所述的方法，具体包括：1).利用Cas9/RNA系统基因编辑技术，构建针对小鼠Igha基因的gRNA，用于指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切DNA双链，得到Cas9打靶载体；2).制作供体载体(Donor vector)，使Donor vector携带靶位点同源臂及敲入元件，所述的敲入元件为人源IGHA1基因组全序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕继成，朱厉，王曼柳，
申请(专利权)人：北京大学第一医院，
类型：发明
国别省市：