一种脱氧核酶分子探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种功能核酸活性调控的方法，包括将所述功能的其中一个或多个碱基修饰，将功能核酸活性封闭。优选地，将所述功能核酸或者功能核酸作用的底物的其中一个或多个碱基修饰，将功能核酸活性封闭之后，还包括将所述修饰基团脱除，活化所述功能核酸。本发明专利技术还提供一种脱氧核酶分子探针，所述脱氧核酶分子探针包括结构域a、结构域b和结构域c。通过筛选得到m6A封闭的Dz，实现了m6A去甲基化酶的高效灵敏检测以及抑制剂小分子药物的筛选和检测。敏检测以及抑制剂小分子药物的筛选和检测。敏检测以及抑制剂小分子药物的筛选和检测。

【技术实现步骤摘要】
一种脱氧核酶分子探针及其应用


[0001]本专利技术专利属于分子检测领域，尤其是指一种脱氧核酶分子探针及其应用。

技术介绍

[0002]脱氧核酶(简称DNAzyme)是一类通过体外筛选得到的具有催化活性的DNA分子。与传统的蛋白酶和Ribozyme相比，DNAzyme由于其化学性质稳定，廉价，易于合成和修饰以及催化活性高等特点，近年来被广泛用于生物传感和临床诊断，尤其是用于细胞内的分析检测。在这些应用中，主要是对DNAzyme的活性进行调控，从而达到检测目标物的目的。而目前对于DNAzyme的活性调控主要有三种常见手段，一是通过控制DNAzyme的辅因子(金属离子)浓度，来调控其活性，而达到检测金属离子的目的；二是利用核酸或小分子来改变DNAzyme的催化活性中心结构，通过恢复DNAzyme的完整结构来激活其活性；三是在其作用的核酸底物或臂端修饰光敏基团，通过外源性的光调控去掉光敏基团，从而达到DNAzyme活性恢复的目的。而以上这些策略，通常设计复杂，通用性低，且属于间接性对DNAzyme进行活性调控。
[0003]肥胖相关蛋白(FTO蛋白)是一种N6
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甲基腺嘌呤(m6A)去甲基化蛋白，越来越多的研究表明FTO在多种肿瘤细胞中过量表达，与肿瘤的形成、发展和转移密切相关，因此对于FTO的检测，尤其是细胞内的检测对肿瘤的早期诊断具有重大意义。而目前对于FTO蛋白的研究主要集中在其致病机理，其体外检测的工作极少。早期检测FTO主要包括凝胶电泳(PAGE)、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)等方法，而这些检测手段普遍存在操作复杂，工作效率低等特点。而后发展的基于荧光的方法，仍然存在检测灵敏度低等缺点，不适合在细胞内复杂环境下的检测。
[0004]综上所述，现有技术中，一方面，目前利用大分子蛋白对DNAzyme活性进行直接调控的研究极少，因此，急需发展一种简便的，可以用细胞内蛋白质(尤其是与肿瘤密切相关的重要蛋白)对DNAzyme活性进行调控的新方法。另一方面，急需发展一种简便高效，适合在细胞内对FTO进行检测的探针。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，基于DNAzyme的高效催化活性和灵活调控特性，发展一种通过FTO蛋白调控DNAzyme活性的方法，达到体外和体内对FTO进行高效检测，同时该DNAzyme探针的成功构建也极大的促进了FTO蛋白小分子抑制剂的筛选，对小分子药物的临床研究具有重要意义。
[0006]在本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种功能核酸活性调控的方法，包括将所述功能核酸或者所述功能核酸作用的底物的其中一个或多个碱基修饰，将所述功能核酸活性封闭。
[0007]优选地，将所述功能核酸的其中一个或多个碱基修饰，将功能核酸活性封闭之后，还包括将修饰基团脱除，活化所述功能核酸。
[0008]进一步地，所述修饰为m6A甲基化修饰。
[0009]进一步地，使用m6A去甲基化酶将所述修饰基团脱除。
[0010]进一步地，所述功能核酸为脱氧核酶或适配体，优选为脱氧核酶。
[0011]脱氧核酶分子探针，以下简称Dz。
[0012]在本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种脱氧核酶分子探针(以下也简称Dz
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Me)，所述脱氧核酶分子探针包括结构域a、结构域b和结构域c；所述结构域a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述结构域b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述结构域c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述结构域c中第五位碱基A被m6A甲基化修饰。
[0013]本专利技术提供的一种脱氧核酶分子探针(以下也简称Dz
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Me)包含结构域a、结构域b、结构域c三部分，结构域c为Dz
‑
Me的催化活性中心，对其活性起着决定性作用，结构域a，结构域b为Dz
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Me的两个臂。
[0014]在本专利技术的第三方面，本专利技术提供一种脱氧核酶分子探针(以下也简称ED5
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Me)，所述脱氧核酶分子探针包括结构域e、结构域f和结构域g；所述结构域e的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述结构域f的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述结构域g的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述结构域g中第五位碱基A被m6A甲基化修饰。
[0015]在本专利技术的第四方面，本专利技术提供一种试剂盒，包括本专利技术第二方面提供的脱氧核酶分子探针和底物S1，所述底物S1包括结构域a*和结构域b*，所述结构域a*和结构域b*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S1的5
’
端标记有荧光团FAM，3
’
端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域a*的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述结构域b*的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016]Dz的结构域a，结构域b分别与底物S1的结构域a*和结构域b*两部分杂交,其中TrAG代表剪切位点，rA代表腺嘌呤核糖核苷酸，其5
’
端标记有荧光团FAM，3
’
端标记有猝灭团BHQ1，两个荧光团之间发生荧光共振能量转移，FAM荧光猝灭。a与a*互补杂交，b与b*互补杂交，Dz可以与底物S1杂交并将rA和G之间切开。首先在体外筛选一个合适的甲基化封闭的Dz，分别在Dz的催化中心和底物上进行m6A甲基化修饰，探究不同甲基化位点对Dz的活性影响，最终筛选得到一个甲基化修饰后，剪切活性被完全封闭的最优Dz(该Dz命名为Dz
‑
Me)。在m6A去甲基化酶(FTO)作用下去掉甲基，Dz
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Me恢复原本活性，剪切底物S1，a*与b*分离，即两个荧光团FAM和BHQ1相互分离，FAM的荧光恢复。同时一个去甲基化后被激活的Dz可以剪切多个底物，产生多个荧光信号。当没有去甲基化酶时，即使Dz
‑
Me和底物S1通过两边的臂杂交在一起，两个荧光团的距离在10nm以内，同样可以发生荧光共振能量转移，FAM的荧光被BHQ1猝灭，没有荧光信号的输出。
[0017]在本专利技术的第五方面，本专利技术提供另一种试剂盒，包括本专利技术第三方面提供的所述的脱氧核酶分子探针和底物S3，所述底物S3包括结构域e*和结构域f*，所述结构域e*和结构域f*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S3的5
’
端标记有荧光团FAM，3
’
端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域e*的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述结构域f*的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0018]在本专利技术的第六方面，本专利技术提供另一种试剂盒，包括本专利技术第二方面提供的脱氧核酶分子探针和底物S2，所述底物S2包括结构域a*、结构域b*、结构域d和结构域d*，所述结构域a*和结构域b*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S2的5
’
端标记有荧光团FAM，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种功能核酸活性调控的方法，其特征在于，包括将所述功能核酸或者所述功能核酸作用的底物的其中一个或多个碱基修饰，将所述功能核酸活性封闭，优选地，将所述功能核酸的其中一个或多个碱基修饰，将所述功能核酸活性封闭之后，还包括将修饰基团脱除，活化所述功能核酸。2.一种脱氧核酶分子探针，其特征在于，所述脱氧核酶分子探针包括结构域a、结构域b和结构域c；所述结构域a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述结构域b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述结构域c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述结构域c中第五位碱基A被m6A甲基化修饰。3.一种脱氧核酶分子探针，其特征在于，所述脱氧核酶分子探针包括结构域e、结构域f和结构域g；所述结构域e的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述结构域f的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述结构域g的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述结构域g中第五位碱基A被m6A甲基化修饰。4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的脱氧核酶分子探针和底物S1，所述底物S1包括结构域a*和结构域b*，所述结构域a*和结构域b*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S1的5
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端标记有荧光团FAM，3
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端标记有猝灭团BHQ1；所述结构域a*的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述结构域b*的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的脱氧核酶分子探针和底物S3，所述底物S3包括结构域e*和结构域f*，所述结构域e*和结构域f*之间设置有腺嘌呤核糖核苷酸，所述底物S3的5
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端标记有荧光团FAM，3
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【专利技术属性】
技术研发人员：王富安，王庆，李丰哲，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：