一种响应潜艇金属Ni2+离子的启动子元件及其制备的电化学信号输出传感器和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种响应潜艇金属Ni

【技术实现步骤摘要】
一种响应潜艇金属Ni
2+
离子的启动子元件及其制备的电化学信号输出传感器和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种响应潜艇金属Ni
2+
离子的启动子元件及其制备的电化学信号输出传感器和应用。

技术介绍

[0002]潜艇由于其隐蔽性高、打击力强的特点，已经成为现代海军的重要组成部分。同时，潜艇作为海洋军事侦查的重要力量，对敌方能够造成巨大威胁。因此，如何实现我国海岸线周边活动潜艇的高效准确探测，是我国海洋防务重点关注的领域。当前潜艇探测方法主要分为声呐探潜和非声探潜，其中非声探潜包括红外、电磁信号检测等等。然而，这些传统的探潜方式存在易暴露、干扰大等不同程度的局限性。近年来，随着现代微生物学及分子生物学技术的快速发展，微生物传感器技术开始受到广泛关注。微生物传感器可以感应环境中各类因素的细微变化，并向外界输出易于被检测的生物信号。因此，基于潜艇舰体及循环水管道释放的金属离子检测的微生物传感器的开发具有重要前景。通过对潜艇合金组成及海水中金属离子分析发现，潜艇合金中含金属镍，而海水中几乎不含该金属元素，因此金属Ni
2+
可作为响应潜艇金属离子的生物传感器的诱导物。目前，开发用于检测潜艇金属离子的生物传感器的主要挑战是高效感应元件的筛选。
[0003]沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是一种紫色非硫细菌(purplenon
‑
sulfur bacteria，PNSB)，在自然界中分布很广泛，主要分布在光照充足的厌氧水环境中，它们既能在厌氧光照条件下以低级脂肪酸、多种二羧酸、醇类、糖类、芳香族化合物等低分子有机物作为光合作用的电子供体进行光能异养生长，又能在黑暗有氧条件下以有机物为呼吸基质进行好氧异养生长。同时，该假单胞菌属在生长时需要金属Ni元素作为微量元素，且其基因组中存在金属Ni相关的编码基因。另外，在海水中传统光学信号的传输受到很多因素的干扰，所以通过荧光信号等建立的传感器具有很大的局限性。而结合微生物生理代谢的特点，利用感应金属Ni
2+
离子的启动子元件实现NAD
+
合成酶和甲酸脱氢酶基因的响应表达，提高胞内电子池(NAD
+
)总量和NADH/NAD
+
的比值，通过构建电化学装置实现感应金属Ni
2+
离子后电化学信号的输出，为筛选探潜的高效微生物传感器提供了新的思路和方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种响应潜艇金属Ni
2+
离子的启动子元件及其制备的电化学信号输出传感器和应用。本专利技术基于转录组学筛选到高效响应潜艇金属 Ni
2+
离子的启动子元件，并利用该启动子元件与NAD
+
合成酶、甲酸脱氢酶基因制备得到电化学信号输出传感器，通过提高胞内电子池(NAD
+
)总量和 NADH/NAD
+
的比值，实现了感应潜艇金属Ni
2+
离子后电化学信号的高输出。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0006]本专利技术提供了一种响应潜艇金属Ni
2+
离子的启动子元件，所述启动子元件的核苷
酸序列如SEQ ID NO.2所示或者如SEQ ID NO.3所示。
[0007]进一步的，所述启动子元件来源于沼泽红假单胞菌，是利用转录组学筛选得到的。
[0008]进一步的，利用转录组学筛选到的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的启动子元件P
0724
能够以高灵敏度响应潜艇金属Ni
2+
离子。
[0009]进一步的，由所述启动子元件P
0724
经定向进化优化后，得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的启动子元件P
0724
‑1对潜艇金属Ni
2+
离子的响应灵敏度显著提高。
[0010]本专利技术还提供了一种包含所述的启动子元件的电化学信号输出传感器，所述电化学信号输出传感器中包括响应潜艇金属Ni
2+
离子的启动子元件、NAD
+
合成酶基因和甲酸脱氢酶基因。
[0011]进一步的，所述电化学信号输出传感器中同时包含响应潜艇金属Ni
2+
离子的启动子元件、NAD
+
合成酶基因和甲酸脱氢酶基因。
[0012]进一步的，所述NAD
+
合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0013]进一步的，所述NAD
+
合成酶基因来源于Rhodopseudomonas palustris；所述甲酸脱氢酶基因来源于Candida boidinii。
[0014]本专利技术还提供了所述的电化学信号输出传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0015](1)利用金属Ni
2+
溶液刺激沼泽红假单胞菌，提取刺激后的沼泽红假单胞菌的RNA进行转录组学分析，找到上调基因；
[0016](2)以沼泽红假单胞菌的基因组为模板，扩增所述上调基因，得到待验证启动子；
[0017](3)将所述待验证启动子与荧光报告基因进行连接，并利用金属Ni
2+
溶液进行荧光检测验证，筛选得到能够响应潜艇金属Ni
2+
离子的启动子元件；
[0018](4)将所述启动子元件与NAD
+
合成酶基因、甲酸脱氢酶基因分别连接，克隆至表达载体pBBR1MCS
‑
5中，得到含有启动子元件的重组表达质粒 pBBR1MCS
‑5‑
P
‑
NADs
‑
fdh
‑
P；
[0019](5)将所述重组表达质粒pBBR1MCS
‑5‑
P
‑
NADs
‑
fdh
‑
P通过接合转移的方式接合至沼泽红假单胞菌中，得到重组工程菌Rpal(pBBR1MCS
‑5‑
P
‑
NADs
‑
fdh
‑
P)，即为电化学信号输出传感器。
[0020]进一步的，所述荧光报告基因为绿色荧光蛋白基因eGFP，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。
[0021]进一步的，所述重组工程菌Rpal(pBBR1MCS
‑5‑
P
‑
NADs
‑
fdh
‑
P)能够在感应金属Ni
2+
离子后诱导表达NAD
+
合成酶和甲酸脱氢酶，实现胞内电子池(NAD
+
) 总本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种响应潜艇金属Ni
2+
离子的启动子元件，其特征在于，所述启动子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或者如SEQ ID NO.3所示。2.一种包含权利要求1所述的启动子元件的电化学信号输出传感器，其特征在于，所述电化学信号输出传感器中包括响应潜艇金属Ni
2+
离子的启动子元件、NAD
+
合成酶基因和甲酸脱氢酶基因。3.根据权利要求2所述的电化学信号输出传感器，其特征在于，所述NAD
+
合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。4.权利要求2或3所述的电化学信号输出传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)利用金属Ni
2+
溶液刺激沼泽红假单胞菌，提取刺激后的沼泽红假单胞菌的RNA进行转录组学分析，找到上调基因；(2)以沼泽红假单胞菌的基因组为模板，扩增所述上调基因，得到待验证启动子；(3)将所述待验证启动子与荧光报告基因进行连接，并利用金属Ni
2+
溶液进行荧光检测验证，筛选得到能够响应潜艇金属Ni
2+
离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建明，王兆宝，马冉，汤若昊，李美洁，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：