RNA寡核苷酸的测序方法技术

本发明专利技术涉及用于对包含RNA的寡核苷酸进行测序的方法，其中在RNA寡核苷酸中引入两个索引化序列。本发明专利技术还涉及此类方法的用途以及用于此类方法的装置。进一步提供包含用于本发明专利技术方法的一种或多种组分的试剂盒。方法的一种或多种组分的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】161,1187
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1201)、10x Genomics Chromium(Zheng等(2017)Nat.Commun.8,14049))的微流控微滴发生器。用于scRNA
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seq的典型微流控装置有四个输入(用于输入细胞、条形码微珠、反转录试剂和载体油)和一个输出(用于输出微滴乳液)。反转录反应通常在微滴内部进行。虽然可变形微珠可以加载到接近饱和，但细胞按有限稀释提供，使得两个细胞不太可能进入同一微滴。如果两个细胞进入同一微滴，则它们将收到完全相同的细胞条形码，并且在下游分析中无法区分。因此，虽然大多数微滴同时含有试剂和微珠，因此功能齐全，但由于它们不含细胞，最终不会被使用。
[0005]亚纳升微孔板和微流控微滴发生器的通量受限于按有限稀释加载细胞以避免细胞双联体(cell doublets)的要求。这些平台通常每个实验的通量约为10,000个细胞(例如，按每个亚纳升孔板或10x Genomics Chromium芯片上的每个通道计)，但这可以通过并行化(多个平板、微流控装置上的多个通道)来提高。然而，这通常成本很高，而且费力。
[0006]在组合索引中，所分析的细胞的数目可以随条码化次数(barcoding rounds)成指数式增长。两轮条码化将允许对大约10,000个细胞进行分析(在使用384x 384个条形码时)，这会产生大量人工操作，但与亚纳升孔板或微滴发生器相比没有任何优势。只有在引入第三轮索引时，才可能处理超过100万个细胞。目前用sci
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RNA
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seq v3产生的最大数据集包含来自发育中的小鼠胚胎的200万个单细胞转录组(Cao等(2019)Nature 566,496
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502)。然而，这有几个缺点：(1)大多数NGS文库制备流程不能与三轮组合索引立即兼容(例如ATAC
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seq、DNA甲基化分析、Hi
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C等测定)。(2)在每个条码化步骤中，即使存在不利的反应缓冲液和高温孵育，细胞核或细胞也必须保持完整。对于三轮条码化，材料损失通常>90％。(3)设计一个简洁的文库读取结构以经济高效地对三个条形码的组合进行测序是一个挑战(当连接突出端必须与条形码一起测序时，如在SPLIT
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seq或sci
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RNA
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seq v3中，这尤其成问题)。(4)条形码中的合成和测序错误累积，使得较大百分比的读段无法可靠地分配。(5)在完整细胞或细胞核上进行反应只是部分有效的。以这种方式进行的反应越多，文库制备的整体效率和产生的单细胞转录组的质量越低。(6)为了达到高细胞数，每轮条码化都必须使用大量索引。例如，为了产生200万个细胞的数据集，使用了384x 384x 768个条形码的组合。就所需的试剂量而言，这既费力又浪费。鉴于这些缺点，很难想象已发表的用于组合索引scRNA
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seq的方法会被研究实验室普遍采用或在商业上取得成功。
[0007]在一个典型的实验中，细胞悬液，连同带有独特DNA条形码的微珠群、反转录试剂和载体油，加载到微流控芯片上(图1a)。当水相和油相以受控的流速组合时，乳液微滴共包封单个细胞和单个微珠。由于缓冲液组成，细胞裂解，细胞大分子释放到微滴中。细胞转录物与微珠连接的互补引物退火，所述引物携带有唯一细胞条形码(unique cell barcode)。对于全转录组应用，这些引物包含一个与信使RNA中的poly
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A尾部互补的oligo
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dT段。但原则上，可以使用任何捕获序列，以便可以选择性富集特定转录物或RNA。在一些实施方案中，通过还原条件或通过紫外线来溶解微珠，以更有效地捕获转录物。在大多数流程中，用乳液微滴作为反转录反应的反应区室，反转录反应将条形码掺入到细胞的转录组中。
[0008]重要的是，如果两个细胞进入相同的微滴或相同的孔，例如在亚纳升孔板上，它们的转录组会被完全相同的细胞条形码标记，从而产生混淆分析的细胞双联体。为了避免这个问题，目前最先进的微滴发生器配备有限稀释的细胞悬液，大多数微滴携带0或1个细胞。这使得微流控scRNA
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seq效率极低。虽然大多数乳液微滴功能齐全(它们同时包含条码化的
微珠和反转录试剂)，但它们未接收细胞，因此不会导致生产性的文库制备事件。
[0009]因此，需要分析RNA寡核苷酸的改进方法，尤其是允许高通量分析的方法。

技术实现思路

[0010]通过本文提供的实施方案，尤其是权利要求书中提供的实施方案，解决该技术问题。
[0011]本专利技术尤其涉及以下项目：
[0012]1.用于对包含RNA的寡核苷酸进行测序的方法，该方法包括以下步骤：
[0013](a)提供包含含有RNA的第一寡核苷酸的经透化的细胞和/或细胞核；
[0014](b)使(a)的所述细胞和/或细胞核在第一反应区室中与含有DNA的第二寡核苷酸组合，其中该第二寡核苷酸至少包含与该第一寡核苷酸的序列至少部分互补的第一序列、含有索引序列的第二序列以及含有引物结合位点的第三序列，其中所述组合在允许该第二寡核苷酸的第一序列与该第一寡核苷酸退火的条件下进行；
[0015](c)在所述细胞/细胞核中反转录第一寡核苷酸以获得延长的第二寡核苷酸；
[0016](d)使步骤(c)中获得的所述细胞和/或细胞核在第二反应区室中与微珠结合的第三寡核苷酸组合，其中该第三寡核苷酸包含：
[0017](i)与步骤(b)中所用的第二寡核苷酸中包含的第四序列对应的第一序列；或
[0018](ii)与第四寡核苷酸的第一序列互补的第一序列，其中该第四寡核苷酸进一步包含与第二寡核苷酸的第三序列至少部分互补的第二序列；
[0019]其中对于(i)，所述方法进一步包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前的第二链DNA合成的步骤，其中对于(ii)，该方法进一步包括DNA连接的步骤；
[0020]且其中，该第三寡核苷酸进一步包含含有索引序列的第二序列和含有引物结合位点的第三序列；
[0021](e)扩增步骤(d)中获得的DNA寡核苷酸；和
[0022](f)对所扩增的DNA寡核苷酸进行测序。
[0023]2.第1项的方法，其中在步骤(c)中，将无模板核苷酸(untemplated nucleotide)添加到第二寡核苷酸的3
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端。
[0024]3.第2项的方法，其中第二链DNA合成包括使用含有与所添加的无模板核苷酸互补的序列的引物。
[0025]4.第2项的方法，其中添加含有与所添加的无模板核苷酸互补的RNA核苷酸的引物进行延伸。
[0026]5.第1项的方法，其中第二链DNA合成包括：
[0027](a)在第一寡核苷酸中引入切口；
[0028](b)延伸带切口寡核苷酸；和
[0029](c)连接所延伸的寡核苷酸。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于对包含RNA的寡核苷酸进行测序的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包含含有RNA的第一寡核苷酸的经透化的细胞和/或细胞核；(b)使(a)的所述细胞和/或细胞核在第一反应区室中与含有DNA的第二寡核苷酸组合，其中该第二寡核苷酸至少包含与该第一寡核苷酸的序列至少部分互补的第一序列、含有索引序列的第二序列以及含有引物结合位点的第三序列，其中所述组合在允许该第二寡核苷酸的第一序列与该第一寡核苷酸退火的条件下进行；(c)在所述细胞/细胞核中反转录第一寡核苷酸以获得延长的第二寡核苷酸；(d)使步骤(c)中获得的所述细胞和/或细胞核在第二反应区室中与微珠结合的第三寡核苷酸组合，其中该第三寡核苷酸包含(i)与步骤(b)中所用的第二寡核苷酸中包含的第四序列对应的第一序列；或(ii)与第四寡核苷酸的第一序列互补的第一序列，其中该第四寡核苷酸进一步包含与第二寡核苷酸的第三序列至少部分互补的第二序列；其中对于(i)，该方法进一步包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前的第二链DNA合成的步骤，其中对于(ii)，该方法进一步包括DNA连接的步骤；其中，所述第三寡核苷酸进一步包含含有索引序列的第二序列和含有引物结合位点的第三序列；(e)扩增步骤(d)中获得的DNA寡核苷酸；和(f)对所扩增的DNA寡核苷酸进行测序。2.权利要求1的方法，其中在步骤(c)中，将无模板核苷酸添加到第二寡核苷酸的3
’
端。3.权利要求2的方法，其中第二链DNA合成包括使用含有与所添加的无模板核苷酸互补的序列的引物。4.权利要求2的方法，其中添加含有与所添加的无模板核苷酸互补的RNA核苷酸的引物用于延伸。5.权利要求1的方法，其中第二链DNA合成包括(a)在第一寡核苷酸中引入切口；(b)延伸带切口的寡核苷酸；和(c)连接延伸的寡核苷酸。6.权利要求1或5的方法，其进一步包括在第二链DNA合成之后或在第二链DNA合成的同时，在所合成的第二链DNA的5
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端引入无模板核苷酸的步骤。7.权利要求6的方法，其中使用转座酶，尤其是Tn5转座酶引入无模板核苷酸。8.权利要求1的方法，其中该方法进一步包括在DNA连接后的线性延伸步骤，其中线性延伸包括添加含有RNA核苷酸的引物和添加反转录酶。9.权利要求1的方法，其中该方法进一步包括线性延伸的步骤，该步骤包括添加含有随机核苷酸的引物。10.权利要求1至9中任一项的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：分子医学研究中心责任有限公司，
类型：发明
国别省市：