用于动物组织的裂解液及其在CUT＆Tag中的使用方法技术

本发明专利技术公开了用于动物组织的裂解液及其在CUT&Tag中的使用方法。本发明专利技术涉及生物技术和表观遗传学技术领域，具体提供了一种适用于动物组织的裂解液及其在CUT&Tag中的应用方法，该裂解液中含有的适量温和性非离子去垢剂NP40(或CA630)及Triton X

【技术实现步骤摘要】
用于动物组织的裂解液及其在CUT＆Tag中的使用方法


[0001]本专利技术属于生物技术和表观遗传学
，具体为用于动物组织的裂解液及其在CUT&Tag中的使用方法。

技术介绍

[0002]DNA与蛋白质的相互作用，在生命体DNA复制与重组、RNA转录、翻译和修饰过程，以及基因的表达调控中发挥着重要作用，其相互作用几乎涉及生物体的所有生命活动。随着2007年，染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP
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seq)首次提出，该技术迅速成为研究人员探究DNA
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蛋白质互作的金标准。但ChIP
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seq技术对样品和数据的需要量大，信噪比和分辨率低。且存在甲醛交联后，引起抗原表位改变等缺陷，从而易造成假阳性结果的出现，制约了其在表观基因组学领域的进一步发展。CUT&RUN(Cleavage under target and release using nuclease)技术作为一项表观遗传学领域重大革新性技术，大大减少了实验所需的细胞量，能在低测序深度的情况下，得到高信噪比的数据，因此在很大程度上可作为ChIP
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seq的代替技术，从而得到了广泛的应用与发展。但CUT&RUN存在成本高、耗时长、工作量大的弊端。2019年，研究人员克服了ChIP
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seq和CUT&RUN技术的局限性，在CUT&RUN基础上，有效的结合了ATAC
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seq技术，从而提出了CUT&Tag技术。染色质靶向切割和标签化(Cut&Tag,Cleavage under target and tagment)是利用Protein A/Protein G与经过改造的Tn5转座子形成融合蛋白，通过Protein A/Protein G与特异性抗体性相互作用，将Protein A/G
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Tn5锚定在特异性抗体区域实现高效快速的切割DNA，在靶向切割的同时，利用转座酶催化双链进行重组交换的特性，在DNA两端加上外源的扩增接头序列对DNA进行标记，从而实现快速、高效、高分辨率的微量DAN建库测序。相较于ChIP
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seq和CUT&RUN技术而言，CUT&Tag技术具有实验周期短，操作简便，信噪比高，重复性好，细胞投入量低等优点，未来甚至可以实现单细胞层面的检测。
[0003]然而，尽管CUT&Tag技术在哺乳动物细胞系上的应用较为成熟，但考虑到组织样本较为稀少，或者组织保存状态略差的情况下，从动物组织中提取大量完好细胞核仍比较困难，所以该技术在动物组织样本中的使用方法并不是十分广泛。鉴于此，本专利技术提出一种适用于动物组织提取细胞核的裂解液配方及其在动物组织CUT&Tag中的使用方法，该专利技术对于探究动物组织样品中DNA与蛋白质互作信息，对于表观遗传学研究，具有重要意义和实用价值。

技术实现思路

[0004]针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本专利技术提供了用于动物组织的裂解液及其在CUT&Tag中的使用方法，该裂解液可以有效的解决现有的技术问题，该方法适用性广，样品需要量少，实验耗时短，操作简便，同时也能适用于保存状态略差的样品。
[0005]本专利技术提供如下的技术方案：本专利技术提出了一种用于动物组织的裂解液，具体由下列重量份数的组分组成：
[0006][0007]所述4
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羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的pH为7.5，所述乙二胺四乙酸的pH为8.0。
[0008]本专利技术提出了一种用于动物组织的裂解液在CUT&Tag中的使用方法，具体包括下列步骤：
[0009](1)称取动物组织样，DPBS重悬清洗组织样；
[0010](2)采用对应重量份数的乙基苯基聚乙二醇或辛基酚聚氧乙稀醚、曲拉通X
‑
100、甘油溶液、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、乙二胺四乙酸、蛋白酶抑制剂和去离子水配置的裂解液在4℃条件下，裂解动物组织样，初提细胞核，获得细胞核悬液，显微镜观察细胞核状态；
[0011](3)采用浓度为37％的低浓度甲醛固定细胞核中DNA
‑
蛋白质之间的互作信息：
[0012]采用37％的低浓度甲醛在室温条件下固定细胞核2分钟，2.5M甘氨酸在室温条件下，终止交联5分钟，显微镜计数，取20
‑
30万个细胞核；
[0013](4)制备完整细胞核：采用下面两种方法中的其中一个即可
[0014]①
细胞核与经处理的ConA beads共同孵育15分钟，通过包被刀豆蛋白的Con A beads与细胞核核膜的多糖结合，形成Con A beads与细胞核复合物，镜检ConA beads与细胞核的结合效果；或
②
不使用Con A beads，通过低速离心的方式，沉淀细胞核；
[0015](5)细胞核与特异性抗体在室温条件下共同孵育2小时，或4℃孵育过夜进行一抗处理；
[0016](6)结合了一抗的细胞核与相应的特异性抗体进行二抗处理，再次在室温条件下共同孵育1小时；
[0017](7)结合了特异性抗体的细胞核，与PA/G
‑
Tn5转座酶共同孵育；在抗体的精准引导下，转座酶靶向切割与特异性抗体互作的基因组DNA序列，并将接头序列插入到DNA片段两端；
[0018](8)加入SDS、EDTA失活PA/G
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Tn5转座酶；加入Proteinase K，消化提取片段化的DNA；
[0019](9)通过PCR扩增，实现微量DNA测序文库构建；
[0020](10)测序文库片段筛选，文库浓度与片段分布检测；
[0021](11)高通量测序，得到DNA与特定蛋白的互作信息。
[0022]进一步地，步骤(2)所述低浓度甲醛固定细胞核中DNA
‑
蛋白质之间的互作信息的方法为：细胞核镜检合格后，使用初始浓度为37％，终浓度为0.1％
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0.2％的单分子甲醛，固定细胞核。
[0023]同样的，本申请提供的裂解液同样适用于执行动物组织ATAC
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seq技术。
[0024]采用上述结构本专利技术取得的有益效果如下：本专利技术提出的用于动物组织的裂解液及其在CUT&Tag中的使用方法，具有以下优点及有益效果：
[0025]1、本专利技术提供的动物组织裂解液Lysis Buffer中含有适量的温和性非离子去垢剂NP40或CA630，可有效的裂解组织团块，促进细胞核的释放，高效获得适用于动物组织CUT&Tag文库构建的细胞核，使得在动物组织层面执行CUT&am本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于动物组织的裂解液，其特征在于，具体由下列重量份数的组分组成：所述4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸的pH为7.5，所述乙二胺四乙酸的pH为8.0。2.根据权利要求1所述的用于动物组织的裂解液在CUT&Tag中的使用方法，其特征在于，具体包括下列步骤：(1)称取动物组织样，DPBS重悬清洗组织样；(2)采用对应重量份数的乙基苯基聚乙二醇或辛基苯基
‑
聚乙烯二醇、曲拉通X
‑
100、甘油溶液、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、乙二胺四乙酸、蛋白酶抑制剂和去离子水配置的裂解液在4℃条件下，裂解动物组织样，初提细胞核，获得细胞核悬液，显微镜观察细胞核状态；(3)采用浓度为37％的低浓度甲醛固定细胞核中DNA
‑
蛋白质之间的互作信息：采用37％的低浓度甲醛在室温条件下固定细胞核2分钟，2.5M甘氨酸在室温条件下，终止交联5分钟，显微镜计数，取20
‑
30万个细胞核；(4)制备完整细胞核：采用下面两种方法中的其中一个即可
①
细胞核与经处理的ConA beads共同孵育15分钟，通过包被刀豆蛋白的Con A beads与细胞核核膜的多糖结合，形成Con A beads...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云霞，赵书红，李新云，付亮亮，郭亚苹，王道远，匡仁卓，胡明阳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：