使用酶促DNA合成和数字微流控的信息存储制造技术

用于在台式DMF驱动器/读取器设备中使用数字微流控(DMF)在盒(cartridge)上进行自由运行合成(FRS)和文库制备步骤(例如，纳米孔文库制备)的方法和设备。库制备)的方法和设备。库制备)的方法和设备。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用酶促DNA合成和数字微流控的信息存储
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求于2020年02月24日提交的标题为“INFORMATION STORAGE USING ENZYMATIC DNA SYNTHESIS AND DIGITAL MICROFLUIDICS”的美国临时专利申请号62/980,747的优先权，该临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
[0003]通过引用并入
[0004]本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被明确地且单独地表明其通过引用被并入。


[0005]用于进行DNA从头酶促合成的数字微流控(DMF)装置和方法。

技术介绍

[0006]使用亚磷酰胺化学的常规DNA合成通常限于约300个碱基的链长度，而酶促合成没有这种固有限制。DNA存储应用可以采用酶促DNA合成策略，使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)来构建ssDNA，而无需通过自由运行合成(FRS)的封闭核苷酸。FRS明显更快、更高效，并且能够生成1000个碱基长的数据流。纳米孔测序可用于检索存储的信息。
[0007]然而，以实用的方式准确且可重复地进行FRS一直具有挑战性，特别是在生成文库和与多个多核苷酸一起使用时。提供允许增强FRS的自动化和控制的装置(设备和系统)和方法将是有益的，包括用于加条形码或其他标记用途，包括用于文库制备。

技术实现思路

[0008]本文描述了用于使用数字微流控(DMF)进行从头酶促DNA合成的方法和装置(例如，系统和/或设备，包括盒)。这些从头酶促DNA合成方法和装置可以配置为执行以下一项或多项：可逆终止子dNTP(RTdNTP)(例如，在类似于边合成边测序的方案中)、可逆终止(其中每个聚合酶分子都用栓系核苷三磷酸进行位点特异性标记)和/或自由运行合成(FRS)。例如，这些方法可用于DNA的加条形码。
[0009]例如，在可逆终止中，当聚合酶将其栓系的dNTP引入到引物中时，其仍然共价附接至3
’
末端，从而阻止其他聚合酶
‑
dNTP缀合物的进一步延伸。然后可以切割接头以使得引物的3
’
末端脱保护以用于后续延伸。这个简单的延伸和去保护的两步反应循环可以迭代以编写定义的序列。这些技术(例如，FRS)中的任何一种可以与一个或多个附加步骤一起使用，如在桌面装置中使用数字微流体(DMF)盒上的文库制备步骤(例如，纳米孔文库制备)。这些方法可以包括dNTP和酶添加、孵育、热循环(PCR)和磁珠清理。这些方法可以成功地用于将A、C、G和T聚合到与顺磁珠栓系的引发剂链上，以产生可用于纳米孔测序的长的合成ssDNA片段。
[0010]在通常情况下，用于进行DNA从头合成的方法和装置可用作制备加条形码的文库的一部分(或技术上，在制备加条形码的文库之前)。例如，可以在形成文库之前使用这些方
法和装置对文库DNA加条形码(以形成加条形码的的文库)，方法是在开始NGS的文库制备工作流程之前对样品加条形码。与文库制备工作流程中的其他加条形码的方案不同，本文所述的方法和装置能够在样品进入文库制备步骤之前进行无PCR的文库制备和对样品加条形码。这可以允许用户在一个试管中混合很多(例如，十个、数百个或数十个或数百个或更多样品)而不是使用，例如，液体处理机器人，单独处理并执行单独的文库制备运行。
[0011]例如，本文描述了使用数字微流控(DMF)进行从头酶促合成(例如，多核苷酸)的方法。在一些实例中，该方法可以是加条形码程序的一部分。该方法可以包括：将具有至少一个基板的盒放置在盒的气隙内，以使得盒的疏水性基部与DMF装置中的驱动电极阵列电接触，其中多个多核苷酸起始片段被栓系在至少一个基板上；向驱动电极通电以通过电润湿将一系列液滴单独移动到基板上，以重复以下过程：
[0012](a)使包含含有单一dNTP类型的酶促混合物的液滴通过包含多个多核苷酸起始片段的至少一个基板；
[0013](b)在至少一个基板上孵育液滴以将一个或单一dNTP类型添加到多核苷酸起始片段的末端；和(c)从至少一个基板上去除液滴；其中重复步骤(a)
‑
(c)以合成多核苷酸。
[0014]这些方法的任何一种可以包括在重复步骤(a)
‑
(c)之前使包含酶(例如，TdT)的液滴通过包含多个多核苷酸起始片段的至少一个基板。
[0015]在这些方法的任何一种中，从至少一个基板去除液滴还包括用一个或多个其他液滴洗涤至少一个基板。洗涤可以通过去除液滴(包括通过电润湿和/或通过抽吸)以将液滴从基板上去除和/或通过一个或多个水、缓冲液等的液滴来完成。
[0016]这些方法中的任何一种都可以包括在多核苷酸合成后停止反应，例如，通过添加螯合剂；例如，通过将包含螯合剂的液滴驱动到一个或多个基板上。
[0017]本文所述的方法可以包括从至少一个基板上去除多个多核苷酸起始片段。例如，该方法包括通过将多核苷酸起始片段与基板分离并可以通过电润湿移动的液滴来洗脱合成的多核苷酸。
[0018]在这些方法的任何一种中，从头合成可以包括自由运行合成(FRS)并且使酶促混合物可以通过包括使包含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和特定核苷酸的液滴通过。
[0019]在这些实例的一些中，从头酶促合成可以是可逆终止子dNTP(RTdNTP)。
[0020]在这些实例的一些中，从头酶促合成包括可逆终止，其中每个聚合酶分子用栓系的核苷三磷酸进行位点特异性标记。
[0021]多个多核苷酸片段被栓系在盒的气隙中的底表面处的至少一个基板上。或者或另外，多个多核苷酸片段被栓系在盒的气隙中的顶表面处的至少一个基板上。或者或另外，多个多核苷酸片段被栓系在气隙内的插入物的至少一个基板上；例如，任何这些方法可以包括将插入物置于盒中。在一些实例中，该方法包括将多个多核苷酸片段栓系在基板上(例如，在磁珠上，在气隙的顶部上，在气隙的底部上等)。
[0022]这些方法中的任何一种都可以包括多个基板的平行处理，可以对这些基板产生不同的序列(并且可以在盒中由装置的控制器控制这些序列)。例如，至少一个基板可以包括位于盒不同区域的多个基板。
[0023]如所提到的，去除液滴可以包括通过抽吸去除液滴。抽吸口可以在靠近(例如，邻近)基板位置的盒上。
[0024]在这些方法的任何一种中，在该过程中可以控制温度(例如，升高、降低、保持等)。例如，该方法可以包括控制保持至少一个基板的气隙的至少一部分的温度。
[0025]如所提到的，在这些方法的任何一种中，步骤(a)
‑
(c)可以在盒的不同区域的多个基板中的每个基板上平行进行。例如，当生成多个不同的代码(例如，条形码)时，在每个位置形成的多核苷酸可能不同。例如，形成加条形码的文库的方法可以包括在形成文库之前平行使用多个不同样品的这些方法的步骤。
[0026本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种使用数字微流控(DMF)进行从头酶促合成的方法，所述方法包括：将具有至少一个基板的盒放置在所述盒的气隙内，以使得所述盒的疏水基部与所述DMF装置中的驱动电极阵列电接触，其中多个多核苷酸起始片段被栓系在所述至少一个基板上；向所述驱动电极通电以通过电润湿将一系列液滴单独移动到所述基板上，以重复以下过程：(a)使包含含有单一dNTP类型的酶促混合物的液滴通过包含所述多个多核苷酸起始片段的所述至少一个基板；(b)在所述至少一个基板上孵育液滴以将一个或所述单一dNTP类型添加到所述多核苷酸起始片段的末端；(c)从所述至少一个基板上去除所述液滴；其中重复步骤(a)
‑
(c)以合成多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括在重复步骤(a)
‑
(c)之前使包含酶的液滴通过包含所述多个多核苷酸起始片段的所述至少一个基板。3.根据权利要求1所述的方法，其中从至少一个基板去除所述液滴还包括用一个或多个其他液滴洗涤至少一个基板。4.根据权利要求1所述的方法，其还包括在合成所述多核苷酸后通过添加螯合剂终止反应。5.根据权利要求1所述的方法，其还包括从所述至少一个基板上去除所述多个多核苷酸起始片段。6.根据权利要求5所述的方法，其还包括通过将所述多核苷酸起始片段与所述基板分离并进入可通过电润湿移动的液滴来洗脱所述合成的多核苷酸。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述从头酶促合成包括自由运行合成(FRS)并且其中使所述酶促混合物通过包括使包含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和特定核苷酸的液滴通过。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述从头酶促合成包含可逆终止子dNTP(RTdNTP)。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述从头酶促合成包括可逆终止，其中每个聚合酶分子用栓系的核苷三磷酸进行位点特异性标记。10.根据权利要求1所述的方法，进一步地其中所述多个多核苷酸片段被栓系在所述盒的气隙中的底表面处的所述至少一个基板上。11.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：米罗库鲁斯公司，
类型：发明
国别省市：