一种测序小环形DNA分子的方法技术

本发明专利技术提供了一种测序小环形DNA分子的方法，包括包括：构建重组转座子片段；富集小环形DNA分子；构建重组小环形DNA分子；验证阳性克隆载体。利用转座子将抗生素抗性基因随机插入到各个小环形DNA分子之中，使得每个重组小环形DNA分子中均至少获得一段抗生素抗性基因，而由于后续培养过程中的培养基添加了相关的抗生素，所以只有成功转化有重组小环形DNA分子的克隆载体才能够在培养基中存活和繁殖，使得所述抗生素抗性基因成为重组小环形DNA分子的“保守序列”，从而能够针对该抗生素抗性基因设计相应的PCR扩增，再于分析小环形DNA分子序列的时候使用软件将抗生素抗性基因序列剔除。列的时候使用软件将抗生素抗性基因序列剔除。

【技术实现步骤摘要】
一种测序小环形DNA分子的方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别涉及一种测序小环形DNA分子的方法。

技术介绍

[0002]在藻类二次内共生的进化过程中，甲藻的叶绿体基因组由传统的包括100
‑
250个基因的100
‑
200kbp大小的单个大环形DNA分子进化成特异性的包括0
‑
2个基因的0.4
‑
10kbp大小的多个小环形DNA分子。这个变化可能是由于叶绿体基因组的分裂或重组。过去一般根据小环形DNA分子的保守序列设计引物，然后采用PCR扩增来分析小环形DNA分子的序列，但是这种方法容易遗漏一些没有保守序列的小环形DNA分子，因此不能测序出甲藻所有的小环形DNA分子；通过PCR扩增和后续的测序、拼接等分析很难获得小环形DNA分子的完整信息。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于提供一种测序小环形DNA分子的方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
[0004]本专利技术的第一方面在于提供了一种测序小环形DNA分子的方法，其步骤包括：
[0005]构建重组转座子片段：将抗生素抗性基因插入转座子，得到重组转座子片段，备用；
[0006]富集小环形DNA分子：将待含有小环形DNA分子的目标细胞裂解，通过凝胶电泳收集长度为0.4
‑
10kbp的小环形DNA分子；
[0007]构建重组小环形DNA分子：通过酶切，将备用的重组转座子片段插入富集所得的小环形DNA分子中，经纯化，获得重组小环形DNA分子；
[0008]验证阳性克隆载体：将构建所得的重组小环形DNA分子转化至克隆载体中，经过含有抗生素的培养基筛选，获得具有抗生素抗性基因的阳性菌株，提取阳性菌株的质粒，以所述抗生素抗性基因作为保守序列设计引物，进行测序分析。
[0009]前述提供的测序小环形DNA分子的方法是通过向最初富集所得的小环形DNA分子插入抗生素抗性基因，并将带有抗生素抗性基因的重组小环形DNA分子转化至克隆载体中，使得克隆载体获得了在含有对应抗生素的培养基中存活和繁殖的能力，并使得抗生素抗性基因成为了重组小环形DNA分子的“保守序列”，从而能够针对该抗生素抗性基因设计相应的PCR扩增来分析小环形DNA分子的序列。
[0010]进一步，含有小环形DNA分子的所述目标细胞为甲藻。
[0011]进一步，所述富集是离心收集培养五周的甲藻前环藻Amphidinium carterae细胞，通过碱裂解所述甲藻，并通过电泳获取0.4
‑
10kbp的产物。通过凝胶电泳，能够准确获得长时间培养的甲藻中长度范围为0.4
‑
10kbp的小环形DNA分子，便于后续利用转座子进行抗生素抗性基因的插入处理。
[0012]进一步，所述抗生素抗性基选自卡那霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、新霉素磷
酸转移酶抗性基因、潮霉素抗性基因、巴龙霉素抗性基因、红霉素抗性基因、氨基苄青霉素抗性基因或四环素抗性基因中的至少一种。
[0013]进一步，所述转座子选自piggyBac转座子、piggyBat转座子、Tc1/mariner转座子、SINE转座子、Ac/Ds转座子、Tn5058转座子、T2
‑
Onc3转座子、EZ
‑
Tn5转座子或Tn4351转座子中的一种。以EZ
‑
Tn5转座子为例，可以通过EZ
‑
Tn5Pmod
‑
3载体(EZ
‑
Tn5
TM
pMOD
‑
3<R6K
γori
/MCS>)获得。EZ
‑
Tn5转座子包括两个连接端口，一个多克隆位点和复制起始位点R6K
γori
。所述连接端口的核苷酸序列为5
’‑
AGATGTGTATAAGAGACAG
‑3’
(SEQ ID NO.1)。
[0014]进一步，所述纯化是通过添加25:24:1体积比的苯酚
‑
氯仿
‑
异戊醇混合物进行抽提。用于生物体组织提取核酸和去除核酸的酶反应后的蛋白质。减少异戊醇在使用时产生的气泡。苯酚使蛋白质变性，同时抑制了RNase的降解作用。氯仿抽提加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。异戊醇减少蛋白质变性操作过程产生的气泡。使用酚:氯仿:异戊醇抽提离心后的上层为含RNA的水相、中间为变性蛋白与DNA，下层为有机溶剂相。静置后产品有分层现象，使用时将产品摇匀后用移液器吸取即可。
[0015]进一步，所述克隆载体选自大肠杆菌、农杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母中的一种。具体可选择TransforMax
TM
Ec100D
TM
pir
+
E.coli，其具有用于复制包含R6Kγ条件复制起点(R6K
γori
)的载体，可适配EZ
‑
Tn5转座子使用。
[0016]进一步，所述转化是通过电转化实施，所述电转化的实施条件为2.5kV，2mm电击杯。
[0017]进一步，所述筛选抗生素抗性基因阳性菌株步骤包括：将转化了所述重组小环形DNA分子的克隆载体不含抗生素的培养基培养1个小时后，转移到含抗生素的固体平板培养基中过夜培养，所述抗生素对应于所述抗生素抗性基因。
[0018]本专利技术的有益效果在于利用转座子将抗生素抗性基因随机插入到各个小环形DNA分子之中，使得每个重组小环形DNA分子中均至少获得一段抗生素抗性基因，而由于后续培养过程中的培养基添加了相关的抗生素，所以只有成功转化有重组小环形DNA分子的克隆载体才能够在培养基中存活和繁殖，使得所述抗生素抗性基因成为重组小环形DNA分子的“保守序列”，从而能够针对该抗生素抗性基因设计相应的PCR扩增，再于分析小环形DNA分子序列的时候使用软件将抗生素抗性基因序列剔除。
附图说明
[0019]图1是富集小环形DNA分子的电泳图；
[0020]图2是实施例X中重组小环形DNA分子的示意图。
具体实施方式
[0021]下面将结合具体实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例1，一种测序小环形DNA分子的方法
[0023](1)为了积累最大量的小环形DNA分子，离心收集培养五周的甲藻前环藻
Amphidinium carterae细胞。
[0024](2)采用细菌质粒分析方法，即碱裂解的方法富集步骤(1)所得甲藻的小环形DNA分子，并通过电本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测序小环形DNA分子的方法，其特征在于，包括步骤：裂解目标细胞，富集小环形DNA分子；将抗生素抗性基因插入转座子，构建重组转座子片段；将所述重组转座子片段插入所述小环形DNA分子中，经纯化，获得重组小环形DNA分子；将所述重组小环形DNA分子转化至克隆载体中，筛选抗生素抗性基因阳性菌株，提取质粒，以所述抗生素抗性基因作为保守序列设计引物，进行测序分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标细胞为甲藻。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述富集是通过碱裂解所述甲藻，并通过电泳获取0.4
‑
10kbp的产物。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因选自卡那霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、新霉素磷酸转移酶抗性基因、潮霉素抗性基因、巴龙霉素抗性基因、红霉素抗性基因、氨基苄青霉素抗性基因或四环素抗性基因中的至少一种。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转座子选自piggyBac转座子、piggy...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓娟，陈基琛，王婉娜，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：