用于确定等位基因频率/突变率的方法和诊断技术

本发明专利技术涉及一种用于在聚合酶链式反应(PCR)的背景下确定核酸中，特别是肿瘤核酸中的等位基因频率和/或突变率的新方法，并且涉及用于此目的的诊断，其中使用至少一种参考核酸(RN)和相对于参考核酸的一种突变序列。该参考核酸和突变序列允许验证聚合酶链式反应(PCR)方法，特别是基于设备参数和样本制备。此外，本发明专利技术涉及相关的诊断和预后方法，特别是用于作为液体活检的一部分的肿瘤诊断。用于作为液体活检的一部分的肿瘤诊断。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定等位基因频率/突变率的方法和诊断
[0001]本专利技术涉及一种用于在聚合酶链式反应(PCR)的背景下确定核酸中，特别是肿瘤核酸中的等位基因频率和/或突变率的新方法，并且涉及用于此目的的诊断，其中使用至少一种参考核酸(RN)和相对于参考核酸的一种突变序列。该参考核酸和突变序列允许验证聚合酶链式反应(PCR)方法，特别是基于设备参数和样本制备。此外，本专利技术涉及相关的诊断和预后方法，特别是用于作为液体活检的一部分的肿瘤诊断。
[0002]目前用于检测肿瘤的方法(例如体液和组织样本中的临床化学测试)或成像方法意味着尽管近年来取得了各种进展，但是通常太晚检测到恶性病变。肿瘤患者中高死亡率的主要原因不是原发肿瘤的发展，而是转移。为了防止肿瘤转移，需要尽可能早地检测到任何恶性病变。此外，需要允许正确区分恶性细胞与正常细胞的方法。假阳性和假阴性结果对受影响的患者均有致命的后果。还需要为肿瘤患者提供准确预后并且允许相应地针对每个患者单独定制的治疗的方法。
[0003]迄今为止，已经在体液(例如血液、尿、唾液)或组织样本中确定了所谓的肿瘤标记物，特别是致癌基因。这些是形成为增强或减弱的肿瘤细胞的组分，并且其变化可以在体液(例如血液、血浆或血清)中检测到。然而，这些肿瘤标记物不允许对肿瘤疾病的一般筛查，因为它们的诊断特异性和灵敏度通常太低。尽管这些肿瘤标记物通常能够比成像方法更早期指示恶性病变，但是它们目前未提供足够的恶性病变检测。
[0004]细胞内组分，主要是核酸(核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA))的分离、表征和分析对于现代微生物学是极其重要的。自从1983年聚合酶链式反应(PCR)专利技术以来，已经开发了大量核酸诊断方法，例如用于检测疾病和病原体。
[0005]在现有技术中，提供这种细胞材料用于后续步骤中的诊断，例如样本制备、提取、浓缩、分离、纯化、反转录、扩增和检测。
[0006]由于通过PCR，特别是“qPCR”(实时定量聚合酶链式反应)、“微滴式数字PCR”(ddPCR)或“二代测序”(NGS，或平行测序，例如“大规模平行测序”)的肿瘤DNA的高效扩增，近年来，已经在肿瘤诊断中建立了所谓的无创液体活检，其中在样本中测试循环游离DNA。这种类型的循环游离DNA(cfDNA)可以例如源自癌症/肿瘤细胞(所谓的ctDNA)。
[0007]癌症患者的平均cfDNA量高于健康测试对象，特别是癌症患者的cfDNA血浆水平在晚期高于中期/早期。ctDNA构成例如cfDNA的1％(正常cfDNA的0.01
‑
90％，取决于肿瘤的分期和位置)。
[0008]然而，非常需要标准，以便不仅能够提供相对的诊断信息，而且能够提供绝对的诊断信息。例如，在WO 2018094183A1中描述了这种标准的使用。
[0009]同样，公开了相关的诊断(权利要求183)。
[0010]目前，商业测试和实验室开发的测试(LDT)都可用于肿瘤诊断需要检测的突变。实验室内标准(例如质粒DNA或合成寡核苷酸)以及构成现有技术的许多其它标准目前被用作验证或校准的质量控制。
[0011]然而，缺点在于，为了验证或校准设备或方法的目的，必须稀释这些实验室内标准本身，并且未提供自动化过程来做这件事，这意味着标准化通常易于出错。此外，不能保证这种稀释液的稳定性，并且取决于来源(例如来自大肠杆菌的质粒DNA)存在RNA污染的风
险。因此，由于缺乏足够的标准化，通过PCR确定的拷贝数在相对和绝对方面可能不正确。
[0012]因此，基于人参考核酸的标准化需要进一步改进，提供进一步的突变序列。人参考核酸和突变序列形成标准。
[0013]令人惊讶的是，专利技术人能够确定，用这种标准，使用然而不含DNA的人血清或血浆样本允许改进验证以及诊断。
[0014]因此，本专利技术解决的问题是提供一种用于检测样本核酸中的等位基因频率和/或突变率的改进方法以及相关诊断，其中预期使用合适的标准。
[0015]该问题通过一种用于通过确定核酸中的等位基因频率和/或突变率来验证聚合酶链式反应(PCR)方法的方法来解决，包括以下步骤：
[0016]a.)在不含DNA的血清或血浆样本中向参考核酸提供至少一种人参考核酸(＝野生型)和一种具有一个或多个突变的人核酸(＝突变核酸)，其中预先确定特定等位基因频率和/或突变率，
[0017]以及任选地
[0018]b.)在不含DNA的血清或血浆样本中提供来自a.)的人参考核酸(＝野生型)，其中等位基因频率和/或突变率为0％，
[0019]以及任选地
[0020]c.)提供不含DNA的血清或血浆样本，
[0021]其中检测a.)中的特定等位基因频率，并且在必要时与b.)和/或c.)进行比较。
[0022]在下文中将上述方法称为“根据本专利技术的验证方法”。
[0023]先前提及的“特定等位基因频率”大于或等于0％，并且尤其可以具有例如0.01％、0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％以及更大的值。
[0024]在本专利技术的含义内，“参考核酸”是指等位基因的任意且已知的人野生型序列。这种等位基因可以从数据库中提取，例如
[0025]COSMIC：https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic，
[0026]Targeted Cancer Care：
[0027]http://targetedcancercare.massgeneral.org/My
‑
Trial
‑
Guide/Diseases/Lung
‑
Cancer/KRAS/G12C
‑
(c
‑
34G
‑
T).aspx，或
[0028]OncoKB：https://oncokb.org/，My Cancer Genome：https://www.mycancergenome.org/。
[0029]在优选实施方案中，参考核酸含量优选为20
‑
600ng，特别是在血清或血浆中400ng DNA，例如400ng/5ml，相当于80ng/ml，相当于在血清或血浆中0.08ng/μl DNA。
[0030]此外，优选的是，参考核酸的大小为50bp至500bp。
[0031]在本专利技术的含义内，“具有一个或多个突变的人核酸”或“突变序列或突变核酸”是指与作为参考核酸的等位基因的人野生型序列相比具有一个或多个突变的这种序列。在此，可以使用已知的突变序列，或者可以相对于人野生型序列引入人工突变。现有技术中描述了制备这种人工突变的方法。重要的是，在根据本专利技术的方法中，该参考序列和突变序列是已知的(例如基于核酸序列描述的)。此外，优选的是，突变序列具有至少一个具有已知突变的肿瘤标记物，例如致癌基因。另外，这种肿瘤标记物序列或致癌基因可以具有进一步的人工突变。
[0032]在优选实施方案中，突变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于通过确定核酸中的等位基因频率和/或突变率来验证聚合酶链式反应(PCR)方法的方法，包括以下步骤：a.)在不含DNA的血清或血浆样本中提供至少一种人参考核酸和一种相对于所述参考核酸具有一个或多个突变的人核酸，其中特定等位基因频率和/或突变率是预先确定的，以及任选地b.)在不含DNA的血清或血浆样本中提供来自a.)的人参考核酸，以及任选地c.)提供不含DNA的血清或血浆样本，其中检测a.)中的所述特定等位基因频率，并且在必要时与b.)和/或c.)进行比较。2.根据权利要求1所述的用于通过确定核酸中的所述等位基因频率和/或突变率来验证PCR方法的方法，其特征在于对来自a.)的多个预先确定的等位基因频率进行所述方法。3.根据权利要求2所述的用于通过确定核酸中的所述等位基因频率和/或突变率来验证PCR方法的方法，其特征在于获得验证和校准曲线。4.根据权利要求1所述的用于确定核酸中的所述等位基因频率和/或突变率来验证PCR方法的方法，其特征在于a.)和b.)中的参考核酸和突变核酸的浓度是预先确定的。5.根据前述权利要求中任一项所述的用于确定核酸中的所述等位基因频率和/或突变率来验证PCR方法的方法，其特征在于所述突变核酸包含至少一种肿瘤标记物。6.根据前述权利要求中任一项所述的用于确定核酸中的所述等位基因频率和/或突变率来验证PCR方法的方法，其特征在于进行qPCR(实时定量聚合酶链式反应)、微滴式数字PCR(...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈亚斯，
申请(专利权)人：森西德有限公司，
类型：发明
国别省市：