研究核酸的方法技术

本发明专利技术提供了用于制备测序文库并研究涉及核酸的分子相互作用的新方法。特别地，本发明专利技术涉及用于制备测序文库的方法，所述方法包括将结合染色质的活性剂添加至包含核酸的样品中；分离由所述活性剂结合的染色质；向分离的染色质中添加转座酶；从染色质中分离核酸；并获得测序文库。此外，本发明专利技术涉及用于绘制涉及核酸的分子相互作用的方法，所述方法包括将结合染色质的活性剂添加至包含核酸的样品中；分离由所述活性剂结合的染色质；向分离的染色质中添加转座酶；从染色质中分离核酸；扩增核酸；为扩增核酸的测序；并鉴定分子相互作用。

Methods for the study of nucleic acid

The invention provides a new method for preparing sequencing libraries and studying molecular interactions involving nucleic acids. In particular, the present invention relates to a method for preparing a sequencing library, which includes adding a reactive agent in combination with a chromatin to a sample containing nucleic acids, separating chromatin bonded by the active agent, adding a transposin to the separated chromatin, separating nucleic acid from the chromatin and obtaining a sequencing library. In addition, the present invention relates to a method for drawing molecular interaction involving nucleic acids, which includes adding a reactive agent combined with chromatin to a sample containing nucleic acids, separating chromatin bonded by the active agent, adding a transposin to the separated chromatin, separating nucleic acid from the chromatin and amplifying nucleic acid; To amplify nucleic acid sequencing and identify molecular interactions.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】研究核酸的方法本专利技术提供了用于制备测序库并研究涉及核酸的分子相互作用的新方法。特别地，本专利技术涉及用于制备测序库的方法，所述方法包括将结合染色质的活性剂添加至包含核酸的样品中；分离由所述活性剂结合的染色质；向分离的染色质中添加转座酶；从染色质中分离核酸；以及获得测序库。此外，本专利技术涉及用于绘制涉及核酸的分子相互作用的方法，所述方法包括将结合染色质的活性剂添加至包含核酸的样品中；分离由所述活性剂结合的染色质；向分离的染色质中添加转座酶；从染色质中分离核酸；核酸扩增；扩增核酸的测序；以及鉴定分子相互作用。核酸与其他化学物质和/或生物分子之间相互作用的知识对研究和医学具有很高的兴趣。研究蛋白质-核酸相互作用的熟知方法是染色质免疫沉淀(ChIP)，任选地随后进行大规模平行测序(ChIP-seq)。例如，在染色质中研究与核酸和/或蛋白质的小分子相互作用的方法是Chem-Seq，在下面进一步描述。ChIP方法允许研究全基因组DNA-蛋白质相互作用。它对理解染色质组织、组蛋白修饰以及转录因子结合模式(使用X-ChIP)及其对健康和疾病中基因调控的影响作出了重大贡献；参见例如Nature(2012)489，第57-74页或Ernst等人(2011)Nature473，第43-49页。然而，ChIP仍然是相对乏味的方案，特别是当应用于低输入样品时(参见例如Greenleaf，W.J。(2014)Methods)。为了从ChIP制备用于下一代测序(＝制备库)的核酸，经典方法包括几个费力的步骤：(i)末端修复纯化的DNA序列以产生具有磷酸化3'端的平端双链DNA片段；(ii)添加A突出端；(iii)将具有互补的T突出端的衔接头连接到具有A突出端的双链末端修复的ChIP-DNA片段。衔接头允许扩增DNA片段，其确保用于质量控制和随后测序的足够量的片段，并且还通过引入用于簇生成的流式细胞末端和条形码序列来准备用于测序程序的片段以进行多重测序实验。经典的方法有几个局限性：(i)通常需要5-10ng的输入材料来产生在低细胞量中不能从ChIP中回收的库。因此，ChIP-seq实验的推荐细胞量在106个细胞的范围内。(ii)库程序依赖于几种酶促反应和DNA纯化，这使得库生成是相对费力的程序。不完善的酶反应以及DNA纯化也降低了回收的库片段的量，这解释了高输入要求。(iii)衔接头可以自连接并且需要从扩增和测序中排除。因此，需要选择大小以针对过量衔接头和衔接头二聚体进行选择。作为衔接头连接的替代方案，开发了其他通过DNA片段的逆转录产生ChIP-seq库的方案；参见Clontech，MountainView，CA的ChIPSeqKit。此外，开发了用于低起始材料量的ChIP-seq方案，例如ichIP(Lara-Astiaso等人(2014)Science345，pp.943-9)，linDA(Shankaranarayanan等人(2011)NatureMethods8，第565-7页)和载体辅助的ChIP(Zwart等人(2013)BMCGenomics14,232或Jakobsen等(2015)BMCGenomics16,46)，但是这些方案需要额外的试剂、动手操作或需要汇集许多样品，这使得它们昂贵、耗时和/或不灵活(参见图1以概述现有技术方法和已知的缺点)。研究小分子与其染色质中蛋白质/核酸靶标相互作用的另一种方法是Chem-seq。该方法采用与大规模平行DNA测序相结合的化学亲和捕获来鉴定小分子与其靶蛋白或DNA相互作用的基因组位点。它首先由Anders等人在NatureBiotechnology(2013)，32(1)，第92-6页中描述。最近描述了用于库制备核酸的另一种方法。该方法利用了用于DNA的同时片段化和衔接头标记(“标签化”)的超活性Tn5转座酶的发展(参见Adey等人(2010)GenomeBiol11，R119)。它使用转座酶，其预装了测序兼容的衔接头。转座酶将其衔接头负载整合到DNA中，同时将其片段化。仅需要少量转座酶来产生基因组DNA库(Adey等人(2010)GenomeBiol11，R119)，用于DNA甲基化分析的亚硫酸氢盐转化的DNA(Wang，Q.等人(2013)NatureProtocols8，2022-2032)，RNA-seqcDNA或其他核酸导入测序就绪库(PicelliS.等人(2014)GenomeResvol.24(12)第2033-2040页)。在上述Pirelli出版物中，从分离的cDNA样品制备库。然而，纯化的核酸的标签化反应对转座酶与核酸的比率变化极为敏感，因为在标签化反应中尤其转座酶的量决定了核酸片段的最终大小分布。因此，所得方法需要进行工作和成本密集型实验来确定转座酶和核酸的合适比率，以实现用于下一代测序或其他下游应用的期望的核酸大小分布。在某些情况下，核酸片段分布和丰度的测定甚至不可行，因此根据尤其在Furey等人(2012)NatureReviewsGenetics13(12)，第840-852页综述的现有技术申请中，不可能找到转座酶与核酸的正确比率来制备测序库。此外，向细胞核添加转座酶可恢复开放染色质的区域，并且在基因组的调控区域中提供核小体定位以及转录因子足迹的信息(BuenrostroJD.等人(2013)NatMeth，第10卷(12)第1213-1218页)。然而，没有系统地将转座酶描述为继ChIP或Chem-Seq之后适合用于从核酸产生测序库。相反，讨论了这种方法的潜在缺点。如在WO2013/078470或WO2014/205296中所述，这些缺点是由ChIP之后对纯化的DNA进行标签化而产生的。因此，ChIP和标签化组合的主要缺点是：(1)已经超声处理成小片段(200-700bp)的ChIPedDNA整体上进一步片段化。因此，标签化可导致达到最低约40bp的最小尺寸的非常小的库片段(Adey等人(2010)GenomeBiol11，R119)，其难以测序，因为推荐150bp至200bp片段作为Illumina测序的最小长度；(2)通过标签化的进一步片段化可能产生每个最初沉淀片段的多个测序读段，这可能妨碍下游分析。作为实例，与300bp片段相比，600bp免疫沉淀DNA片段可以产生两倍量的库片段，由此人工增加600bp区域中的相对读段量。这在分析ChIP-seq数据时，对于正确的峰值调用可能是有问题的；(3)使用纯化的ChIPDNA通过标签化来产生测序库的方法是不方便的，因为需要正确的大小测定和DNA定量来建立标签化反应。由于样品和DNA量之间的超声处理可能有所不同，通常根据用于IP的抗体在数量级上变化，需要在标签化之前针对每个ChIP样品确定这些参数；(4)使用纯化的ChIPDNA通过标签化来产生测序库的方法通常也是不可能的，因为ChIPDNA量可能太低而不能进行稳健的定量和大小确定，这两者都是建立稳健的标签化反应的关键参数；和/或(5)纯化的ChIPDNA的标签化不保留免疫沉淀靶区域处局部染色质结构的潜在信息。在WO2013/078470中描述的另一种称为TAM-ChIP的方法利用与针对ChIP的抗体缀合的Tn5转座酶。也就是说，也如WO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备测序文库的方法，所述方法包括：(a)将结合染色质的活性剂添加至包含核酸的样品中；(b)分离由所述活性剂结合的染色质；(c)向步骤(b)的分离的染色质中添加转座酶；(d)从染色质中分离核酸；和(e)获得测序文库。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.12 EP 15180705.4;2015.10.14 EP 15189788.11.制备测序文库的方法，所述方法包括：(a)将结合染色质的活性剂添加至包含核酸的样品中；(b)分离由所述活性剂结合的染色质；(c)向步骤(b)的分离的染色质中添加转座酶；(d)从染色质中分离核酸；和(e)获得测序文库。2.制备测序文库的方法，所述方法包括：(a)将结合染色质的抗体添加至包含核酸的样品中；(b)分离由所述抗体结合的染色质；(c)向步骤(b)的结合和分离的染色质中添加转座酶；(d)从染色质中分离核酸；和(e)获得测序文库。3.绘制涉及核酸的分子相互作用的方法，所述方法包括：(a)将结合染色质的活性剂添加至包含核酸的样品中；(b)分离由所述活性剂结合的染色质；(c)向步骤(b)的分离的染色质中添加转座酶；(d)从染色质中分离核酸；(e)扩增核酸；(f)对扩增的核酸测序；和(g)鉴定分子相互作用。4.绘制涉及核酸的分子相互作用的方法，所述方法包括：(a)将结合染色质的抗体添加至包含核酸的样品中；(b)分离由所述抗体结合的染色质；(c)向步骤(b)的结合和分离的染色质中添加转座酶；(d)从染色质中分离核酸；(e)扩增核酸；(f)对扩增的核酸测序；和(g)鉴定分子相互作用。5.如权利要求1至4所述的方法，其中所述包含核酸的样品已经通过以下步骤制备(i)培养并收获细胞；(ii)固定细胞；(iii)裂解细胞并由此获得包含核酸的第一样品；和(iv)对第一样品进行超声处理并由此获得包含核酸的第二样品，其中所述第二样品将用于条目1或2的方法中。6.如权利要求1至5所述的方法，其中所述方法还包括逆转在固定细胞期间引入的交联的步骤。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述核酸是DNA。8.如权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述细胞包含核酸-蛋白质复合物。9.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞是人类细胞、动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、古细菌细胞、植物细胞或病毒。10.如权利要求9所述的方法，其中所述人类细胞或动物细胞是患病细胞或未患病细胞或来自患病或未患病组织的细胞。11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述人类细胞或动物细胞是癌细胞、免疫细胞、血细胞或干细胞。12.如权利要求11所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·博克，C·施米德尔，
申请(专利权)人：分子医学研究中心责任有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT