一种组合启动子pctsR-α2及其应用制造技术

本发明专利技术通过对枯草芽孢杆菌来源的启动子分析改造获得了一种强度提高的新型组合启动子pctsR

【技术实现步骤摘要】
一种组合启动子pctsR
‑
α
2及其应用


[0001]本专利技术属于微生物与基因工程
，具体涉及一种组合启动子pctsR
‑
α2及其应用。

技术介绍

[0002]碱性蛋白酶(Alkaline protease)，一类能够催化水解肽键的酶，其活性中心含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶，在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，它不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。这类酶广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中，酶活性可受到二异丙基磷酰氟(DFP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和马铃薯抑制剂(PI)等的专一性抑制。
[0003]碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高等优势，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。
[0004]解淀粉芽胞杆菌作为一种革兰氏阳性细菌，由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强、重组DNA比较容易转入的特点和良好的发酵基础及生产技术，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主，成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。
[0005]而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用高强度且易控制的启动子。启动子(promoter)是一段RNA聚合酶(RNA polymerase，RNA Pol)识别、结合和起始转录的特定DNA序列。细菌启动子是与RNA聚合酶结合的靶序列，是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。因此，筛选获取强启动子，是介导蛋白酶基因的表达并提高碱性蛋白酶产量非常有效的方法。

技术实现思路

[0006]针对当前产业需求和现有技术的不足，本专利技术主要目的是提供一种实现目的基因高效表达的启动子及基因工程菌表达系统。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采取如下的技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种组合启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0009]第二方面，本专利技术提供包含所述组合启动子的表达载体。
[0010]第三方面，本专利技术提供包含如上所述组合启动子或表达载体的表达系统。
[0011]第四方面，本专利技术提供如上所述组合启动子的用途，其用于控制基因表达，尤其应用于解淀粉芽孢杆菌代谢工程领域。
[0012]有益效果：
[0013]本专利技术通过对枯草芽孢杆菌来源的启动子分析改造获得了一种强度提高的新型
组合启动子，该组合启动子适用于解淀粉芽孢杆菌表达系统，可将碱性蛋白酶表达活性提高110％，为介导解淀粉芽胞杆菌表达系统中异源碱性蛋白酶基因的表达奠定基础，推动碱性蛋白酶的高效表达及工业化生产。
附图说明
[0014]图1：实施例2中重组载体各片段回收验证；其中，M：Marker；1：启动子pctsR。
[0015]图2：实施例2中重组载体各片段回收验证；其中，M：Marker；，1：启动子pctsR
‑
α2；2：对照启动子ply
‑
2。
[0016]图3：实施例2中重组菌株表达碱性蛋白酶活性对比。
具体实施方式
[0017]下面通过具体的实施方案进一步叙述本专利技术。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。
[0018]第一方面，本专利技术提供一种组合启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0019]第二方面，本专利技术提供包含所述组合启动子的表达载体。所述表达载体的骨架可以是任何本领域已知的枯草芽孢杆菌的表达载体。
[0020]根据本专利技术一种优选的实施方式，所述表达载体是pWB980。
[0021]第三方面，本专利技术提供包含如上所述组合启动子或表达载体的表达系统。所述表达系统可以是适合于本专利技术的组合启动子或表达载体的任何宿主，例如解淀粉芽孢杆菌。
[0022]根据本专利技术一种优选的实施方式，所述宿主是解淀粉芽胞杆菌基因工程菌
△6△
eps
△
pgs
△
3049
‑
3052(该基因工程菌是以CGMCC No.11218出发敲除六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs和噬菌体相关基因3049
‑
3052获得，具体可参见专利申请202111182462.6)。
[0023]第四方面，本专利技术提供如上所述组合启动子的用途，其用于控制基因表达，尤其应用于解淀粉芽孢杆菌代谢工程领域。
[0024]根据本专利技术一种优选的实施方式，所述组合启动子用于控制碱性蛋白酶基因aprE在解淀粉芽孢杆菌系统中的表达，优选的，所述碱性蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，GenBank：FJ940727.1。
[0025]以下将通过具体的实施例对本专利技术进行更详细描述。如无特别说明，以下实施例中：
[0026]本专利技术所用培养基及酶活测定方法：
[0027]种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
[0028]发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L。
[0029]枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：
[0030]SP
‑
A盐溶液：(NH4)2SO
4 4g/L，K2HPO4·
3H2O 28g/L，KH2PO
4 12g/L，柠檬酸钠2g/L；
[0031]SP
‑
B盐溶液：MgSO4·
7H2O 0.4g/L；
[0032]100
×
CAYE溶液：酪蛋白水解物20g/L，酵母粉100g/L；
[0033]SPI(200mL)：SP
‑
A盐溶液98mL，SP
‑
B盐溶液98mL，50％葡萄糖2mL，100
×
CAYE 2mL；
[0034]SPII培养基(600mL)：SPI 588mL，50mmol/L CaCl
2 6mL，250mmol/L MgCl
2 6mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合启动子，其特征在于，所述组合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。2.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述组合启动子。3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的骨架是pWB980。4.一种表达系统，其特征在于，包含权利要求1所述组合启动子或权利要求3所述表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，李玉，张莹，王兴吉，刘文龙，李庆刚，刘逸寒，史超硕，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：