用于生产11α-左旋乙基双酮的雷斯青霉重组菌的构建及其应用制造技术

本发明专利技术专利提供了一种用于制备重要药物中间体11α

【技术实现步骤摘要】
用于生产11
α
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左旋乙基双酮的雷斯青霉重组菌的构建及其应用

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[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体涉及利用DNA重组技术、农杆菌转化法的技术手段构建赭曲霉C11α
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羟化酶基因在雷斯青霉中异源表达的重组菌株，可以用于高效生产C11α
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羟基左旋乙基甾烯双酮。

技术介绍
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[0002]甾体化合物是指分子结构中含有环戊烷多氢菲母核的一类脂溶性小分子化合物，通过在甾体母核的特定位点引入官能基团，可形成一系列具有独特生理功能的化合物。这些甾体激素类药物主要包括蛋白同化激素、肾上腺皮质激素和性激素这三大类，具有抗炎、抗过敏、调节生理功能等重要作用，在医药领域有着广泛的发展前景。
[0003]从自然界中获取的甾体化合物往往活性较低，为了增强其药用活性以及减少毒副作用，需要对其结构的特定部位进行改造。目前对甾体结构的改造主要有两种方法，同全化学合成法相比，微生物转化法不仅专一性强、立体选择性高，而且也避免了步骤繁琐，显著提高了产物得率，同时也是一个环境友好型绿色过程。
[0004]目前，羟化反应是甾体微生物转化中最重要也是应用最多的反应，其中C11α
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羟基化反应是制备甾体类激素药物及重要中间体的关键技术之一。左旋乙基双酮是重要的甾体药物合成原料，其主要用途之一是通过羟基化反应生成15α
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羟基左旋乙基甾烯双酮和11α
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羟基左旋乙基甾烯双酮。这两种羟基化产物都是合成避孕药过程中重要的中间体。其中，11α
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羟基左旋乙基甾烯双酮是用于合成地索高诺酮(国内外普遍认为是一种优于现在广泛使用的炔诺酮和18
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甲基炔诺酮的新型避孕药物)的重要中间体。然而，目前在C11α位上引入羟基来合成C11α
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羟基左旋乙基双酮是制约生产地索高诺酮整条路线的关键步骤。
[0005]当前，赭曲霉是工业上甾体C11α
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羟化反应的重要微生物菌种。虽然赭曲霉有较强的甾体化合物11α
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羟化能力，但该菌株在发酵过程中往往会产生大量的砖红色素从而严重影响产物的分离提纯；其次赭曲霉也会产生次级代谢产物——赭曲霉毒素(OTA)，它具有强烈的肝脏和肾脏毒性以及潜在的致癌和突变能力。而对雷斯青霉ATCC10490菌株分子遗传操作技术成熟，且在发酵过程中基本不会产生毒素和色素而影响产物的分离提纯，是构建甾体羟化酶基因异源表达的理想宿主。因此，本专利技术以雷斯青霉ATCC10490作为出发菌株，构建了一种用于生产C11α
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左旋乙基双酮的雷斯青霉重组菌。首先对课题组前期从赭曲霉Aspergillus ochraceus TCCC41060中鉴定的11α
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甾体羟化酶基因CYPP68J5进行定向改造，获得一个羟化活性强且特异性显著提高的突变体T367V。再以雷斯青霉15α羟化酶基因PRH的启动子作为敲除载体的同源臂，体外构建了一个敲除载体pPZp
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Δ13
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CYP68J5m367。鉴于在丝状真菌的遗传转化方法中，农杆菌转化法有独特的优点，因此本专利技术运用农杆菌介导转化的手段将T367V定点整合在15α羟化酶基因PRH的位置上，实现C11α羟化酶基因的高效异源表达，获得的C11α羟化酶突变体重组菌可以用于高效制备药物中间体C11α
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羟基左旋乙基甾烯双酮。

技术实现思路
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[0006]本专利技术的目的在于提供了一种高效表达C11α羟化酶基因的新型雷斯青霉重组菌，可以用于重要药物中间体11α
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左旋乙基双酮的高效制备；同时也构建了一个羟化活性强且特异性显著提高的C11α羟化酶突变体T367V。
[0007]本专利技术实现目的的技术路线如下：以实验室前期构建的酵母重组载体pYES2
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CYP68J5为基础，利用定点突变技术对该11α羟化酶CYP68J5进行定向改造，获得一个羟化特异性显著提高的突变体pYES2
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CYP68J5m367。再以野生雷斯青霉ATCC10490基因组上的PRH基因的左右臂设计同源臂，通过DNA重组技术构建了一个敲除载体pPZP
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Δ13
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CYP68J5m367。将该敲除载体电转化至农杆菌AGL
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1的感受态细胞中，得到正确的转化子。最终利用农杆菌共培养技术，使该11α羟化酶基因CYP68J5m367定点整合在野生雷斯青霉ATCC10490的PRH基因位置上，实现该基因的异源表达，从而获得一种新型的用于生产11α
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左旋乙基双酮的雷斯青霉重组菌。
[0008]有益效果：
[0009]本专利技术提供了一种用于高效制备重要药物中间体11α
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左旋乙基甾烯双酮的新型雷斯青霉重组菌株。同时，本专利技术也构建了一种羟化活性强且特异性显著提高的C11α
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羟化酶突变体T367V以及酵母菌重组菌。
[0010]说明书附图说明：
[0011]图1：左旋乙基甾烯双酮的C11α
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羟基化反应
[0012]图2：突变体CYP68J5m367琼脂糖凝胶电泳验证条带
[0013]其中：M为DNA Marker；1、2：均为基因片段
[0014]图3：重组表达质粒pYES2
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CYP68J5m367酶切验证图
[0015]其中：M为DNA Marker，1、2：均是挑选的大肠杆菌单菌落提质粒双酶切验证
[0016]图4：酵母重组菌突变体T367V转化底物双酮TLC结果图
[0017]其中：1：双酮标品；2：野生pYES2
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CYP68J5酿酒酵母；
[0018]3：经突变的pYES2
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CYP68J5m367酿酒酵母；
[0019]图5A：重组质粒pBlue
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HYG
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POHR单酶切验证图
[0020]其中：M为DNA Marker，1
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7：分别是重组质粒经过KpnI单酶切的验证条带
[0021]图5B：重组质粒pBlue
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HYG
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POHR单酶切验证图
[0022]其中：M为DNA Marker，1
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7：分别是重组质粒经过BamHI单酶切的验证条带
[0023]图6：目的片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
[0024]其中：M为DNA Marker，1：为目的片段R370，2：为目的片段CYP68J5m367
[0025]图7：重叠目的片段R370
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CYP68J5m367扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
[0026]其中：M为DNAMarker
[0027]图8：重组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.C11α
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羟化酶基因突变体T367V其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在如SEQ ID NO：1所示的序列基础上，由原来的苏氨酸密码(ACG)突变成缬氨酸密码(GTG)。2.权利要求1所述的C11α
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羟化酶基因突变体T367V其特征在于，用于工业转化左旋乙基双酮生产C11α
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左旋乙基双酮。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，C11α
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羟化酶基因突变体T367V转化甾体左旋乙基双酮时羟化特异性提高，副产物明显减少。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于重组表达载体或重组酿酒酵母宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓光，贾曦，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：