一种催化靛蓝生物合成的P450突变酶制造技术

本发明专利技术涉及一种催化靛蓝生物合成的P450突变酶，所述P450突变酶生物合成靛蓝的反应活性显著提高；本发明专利技术涉及的突变酶利用双功能小分子生物合成靛蓝，克服了P450酶催化应用一直受到昂贵的辅因子NAD(P)H及其复杂的电子传递体系的限制，对于工业化微生物合成靛蓝，开发高效靛蓝生物合成的酶具有重要价值。高效靛蓝生物合成的酶具有重要价值。高效靛蓝生物合成的酶具有重要价值。

【技术实现步骤摘要】
一种催化靛蓝生物合成的P450突变酶


[0001]本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种催化靛蓝生物合成的P450突变酶。

技术介绍

[0002]靛蓝(Indigo，CAS No.482
‑
89
‑
3)是一种蓝色粉末状物质，其分子式为C
16
H
10
N2O2，结构式如下：
[0003][0004]其溶解性较差，微溶于水和乙醇，易溶于二甲基亚砜(DMSO)。
[0005]靛蓝用途广泛，广泛用于食品、医药和印染工业。在印染工业方面，靛蓝用作染料已有几千年历史，可以染制丝、毛、棉、麻等纺织品，是古代应用最广泛和最重要的染料，被誉为“染料之王”。在食品工业方面，天然靛蓝及其磺酸钠盐或铝化的形式可用作食用色素，我国称之为亮蓝(GB7655.1
‑
1996)和亮蓝铝淀(GB7655.2
‑
1996)。在医药工业方面，靛蓝及其同分异构体靛玉红是传统中药板蓝根、大青叶及青黛的主要活性成分，能有效应对流行性感冒。另外，靛蓝还具有抗菌、抗炎、抑制肿瘤细胞增殖等作用。
[0006]起初，靛蓝是从植物(木蓝和菘蓝等)提取制成，但提取方法工艺繁琐，产量低，而且受时间、地域限制。随着对靛蓝需求不断增长，化学合成工艺日渐兴起，工业过程取代了以植物为基础的靛蓝生产。目前大规模生产过程通常依赖苯胺作为廉价的化学原料合成靛蓝，但化学合成法生成有毒副产物、危害健康，污染环境，目前对于工业化生物合成靛蓝困难，所以开发高效靛蓝生物合成的酶具有重要价值。
[0007]细胞色素P450单加氧酶(cytochromes P450 monooxygenase,P450或CYP)是以半胱氨酸为轴向配体、以亚铁血红素作为活性中心的含铁氧化酶超级家族。天然P450酶能在温和条件下高选择性的催化包括羟化、环氧化、杂原子氧化等多种类型的反应，但其催化应用却一直受到昂贵的辅因子NAD(P)H及其复杂的电子传递体系的限制，这种限制在一定程度上制约了P450酶的工业应用尤其是体外催化应用。
[0008]中国专利文献CN110128364A(申请号：201810126862.7)一种激活酶催化反应的双功能小分子化合物及其应用，公开了双功能小分子能够激活P450酶利用H2O2对底物进行催化反应的应用，反应过程中不需要额外添加辅因子NAD(P)H及还原伴侣蛋白就能实现催化氧化。
[0009]中国专利文献CN102747053A(申请号：201210257003.4)公开了一种细胞色素P450BM
‑
3突变酶及其编码基因和用途，该专利技术通过定点突变，在细胞色素P450BM
‑
3(F87V/A74G/L188Q)突变酶的基础上引入了三个突变位点，即168位点由天冬氨酸(D)突变为亮氨酸(L)，435位点由谷氨酸(E)突变为苏氨酸(T)，445位点由缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，该突变体命名为P450BM
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3(D168L/E435T/V445A)，该专利文献专利技术人还申请了其他细胞色素P450BM
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3突变体酶，但是所涉及的突变体与本专利技术涉及的P450突变酶的突变位点不同。
[0010]中国专利文献CN109423482A(申请号：201710731112.8)公开了一种催化cyperenoic acid羟基化的细胞色素P450 BM3突变酶，该专利技术涉及的细胞色素P450BM3突变酶选择性催化cyperenoic acid，生产7β
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hydroxy
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cyperenoic acid和9α
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hydroxy
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cyperenoic acid，该专利文献涉及的突变酶与本专利技术涉及的P450突变酶的突变位点不同。

技术实现思路

[0011]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种催化靛蓝生物合成的P450突变酶。
[0012]本专利技术采用双功能小分子驱动体系研究P450突变酶生物合成靛蓝。
[0013]本专利技术的技术方案如下：
[0014]双功能小分子Im
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C6
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Phe利用P450突变酶在生物合成靛蓝中的应用，所述双功能小分子Im
‑
C6
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Phe结构式如下：
[0015][0016]根据本专利技术优选的，所述P450突变酶包括P450 BMP
‑
F87G
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T268V突变酶，以P450BMP
‑
F87G
‑
T268V突变酶为父本，在如下4个位点至少突变一个位点叠加的P450突变酶，所述4个位点为F77I即第77位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸、E140D即第140位的谷氨酸突变为天冬氨酸、R190Q即第190位的精氨酸突变为谷氨酰胺、L277M即第277位的亮氨酸突变为甲硫氨酸；所述P450 BMP
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F87G
‑
T268V突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。
[0017]进一步优选的，所述P450 BMP
‑
F87G
‑
T268V突变酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示。
[0018]进一步优选的，所述P450突变酶为：P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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E140D突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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R190Q突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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R190Q突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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E140D
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R190Q突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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E140D
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
‑
R190Q
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.双功能小分子Im
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C6
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Phe利用P450突变酶在生物合成靛蓝中的应用，所述双功能小分子Im
‑
C6
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Phe结构式如下：。2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述P450突变酶包括P450 BMP
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F87G
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T268V突变酶，以P450 BMP
‑
F87G
‑
T268V突变酶为父本，在如下4个位点至少突变一个位点叠加的P450突变酶，所述4个位点为F77I即第77位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸、E140D即第140位的谷氨酸突变为天冬氨酸、R190Q即第190位的精氨酸突变为谷氨酰胺、L277M即第277位的亮氨酸突变为甲硫氨酸；所述P450 BMP
‑
F87G
‑
T268V突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述P450突变酶为：P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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E140D突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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R190Q突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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R190Q突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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E140D
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R190Q突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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E140D
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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R190Q
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D
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R190Q突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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R190Q
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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E140D
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R190Q
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L277M突变酶或P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D
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R190Q
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L277M突变酶；优选的，所述P450 BMP
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F87G
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T268V突变酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；优选的，所述P450突变酶为：P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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E140D突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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R190Q突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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L277M突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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R190Q突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D
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R190Q突变酶或P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D
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L277M突变酶；优选的，所述P450突变酶为P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D突变酶，该突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2；优选的，所述P450突变酶为P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I
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E140D突变酶，该突变酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1。4.一种催化靛蓝生物合成的P450突变酶包括：以P450 BMP
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F87G
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T268V突变酶为父本，在如下4个位点至少突变一个位点叠加的P450突变酶，所述4个位点为F77I即第77位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸、E140D即第140位的谷氨酸突变为天冬氨酸、R190Q即第190位的精氨酸突变为谷氨酰胺、L277M即第277位的亮氨酸突变为甲硫氨酸；所述父本酶P450 BMP
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F87G
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T268V突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示。5.如权利要求4所述P450突变酶，其特征在于，所述P450突变酶为：P450 BMP
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F87G
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T268V
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F77I突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V
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E140D突变酶、P450 BMP
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F87G
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T268V

【专利技术属性】
技术研发人员：丛志奇，孔繁慧，陈杰，刘传飞，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：